非甾類同化激素類藥殘留分析前處理方法——凈化（一）

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

(3)凈化方法

經典的凈化處理方法主要有液液分配(LLP)，隨著科學技術的發展和獸藥殘留檢測要求的不斷提高，各種新技術、新手段也被用來作為生物樣品中非甾類同化激素的樣品前處理方法，包括固相萃取(SPE)、分子印跡(MIT)、免疫親和色譜(IAC)、固相微萃取(SPME)、基質固相分散法(MSPD)等。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP是利用樣本中的待測物與干擾物在互不相溶的兩種溶劑(溶劑對)中分配系數的差異進行分離的凈化方法，通常使用一種能與水相溶的極性溶劑和一種不與水相溶的非極性溶劑配對來進行分配，經過反復多次分配，使待測物與雜質分離。LLP是最常用的凈化手段，常與其他方法結合用于提取液的脫脂等。

Shin等采用LLP方法提取和凈化老鼠血清中的ZON。在老鼠血清中加入叔丁基甲基醚，渦動混合，離心，有機層氮氣吹干，加入乙腈-0.1%三乙胺溶液(50+50，v/v)復溶，渦動混合，離心后，取上清液HPLC分析。該方法回收率為79.3%～96.2%，日內和日間CV低于12.1%，LOQ為10ng/mL。曹瑩等利用LLP凈化雞肝臟中ZER殘留。雞肝酶解液中加入乙醚，旋渦振蕩，離心，吸取上層液，旋轉蒸發至干后，加入二氯甲烷和1mol/L氫氧化鈉溶解，上清液用乙酸調節pH5，用乙醚LLP凈化，收集上層溶液，旋轉蒸發至干，殘余物用0.3%乙酸-乙腈(55+45，v/v)溶解，供LC-MS分析。該方法的LOQ為4ng/g，回收率為65.0%～86.4%，CV為5.1%～15.4%。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE利用吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，使其與樣品基體、干擾物質分離，然后通過洗脫液洗脫或加熱解吸附，分離和富集目標物。與傳統LLP相比，SPE不需要大量有機溶劑，不產生乳化現象，可凈化很小體積的樣品，是目前獸藥殘留分析中樣品前處理的主流技術。但SPE易將共存干擾物萃取出來，且富集倍數有限。

A.二苯乙烯類

在二苯乙烯類化合物的分析方法中，硅膠柱、HLB柱、石墨化碳黑(GCB)柱、氨基柱(NH2)和硅藻土柱等都被用于動物基質中二苯乙烯類的凈化。

許泓等采用硅膠SPE柱凈化動物源食品中的DES、HES和DIS殘留。用6mL正已烷分兩次預洗硅膠柱，流速4mL/min；上樣，流速2mL/min，在樣品試管中加入3mL淋洗液(乙酸乙酯-正己烷，6+94，v/v)，混合后過柱，流速2mL/min；用3mL淋洗液以3mL/min流速淋洗，2mL空氣流以4mL/min流速吹過硅膠柱；用6mL洗脫液(乙酸乙酯-正己烷，25+75，v/v)洗脫，流速2mL/min，2mL空氣流以6mL/min流速吹過硅膠柱，收集洗脫液，氮氣吹干，加1mL流動相(乙腈-水，70+30，v/v)溶解后，供LC-MS/MS測定。該方法對DES、DIS的LOD為0.05ng/g，在0.5～10ng/g范圍內，回收率為84%～108%；對HES的LOD為0.025ng/g，在0.25～5ng/g范圍內，回收率為59%～87%。

吳銀良等也利用硅膠SPE柱凈化動物組織中DES、DIS和HES。在堿性條件下用乙酸乙酯提取，提取液過硅膠SPE柱(5mL正己烷、5mL乙酸乙酯活化)，依次用2mL正已烷、2mL正己烷-乙酸乙酯(85+15，v/v)混合溶劑淋洗，并抽干，用4mL正已烷-乙酸乙酯(80+20，v/v)混合溶劑洗脫，收集洗脫液，GC-MS分析。方法的LOD為0.30μg/kg(DES)、0.10μg/kg(HES)和0.15μg/kg(DIS)；在0.5～4.0ug/kg添加水平，回收率為73.0%～86.5%，RSD為1.0%～7.2%。Lohne等用乙腈提取魚肉中的DES、DIS和HES，然后用硅膠SPE柱凈化，LC-MS/MS測定。DIS、DES和HES的平均回收率分別為119%、99%和104%，RSD分別為18%、11%和15%；LOD低于0.21ng/g，LOQ在0.18～0.65ng/g之間。

徐英江等用HLB柱凈化草魚血液、肌肉和肝臟中的DES。采用10%碳酸鈉和乙酸乙酯提取，提取液用1mL甲醇溶解殘留物，再加9mL水稀釋，過SPE柱。HLB小柱依次用10mL乙酸乙酯、10mL甲醇和10mL pH3的鹽酸溶液活化，上樣后，用10mL水-甲醇(9+1，v/v)淋洗，抽干，再用10mL正已烷淋洗，抽干，用5mL乙酸乙酯洗脫。控制整個過程流速不超過2mL/min。收集洗脫液，氮吹至近干，流動相復溶、過膜，進LC-MS/MS測定。該方法LOD可達0.5μg/kg，LOQ可達1.0μg/kg；DES的平均回收率在85.0%～108%之間，批內RSD在7.12%～8.65%之間；DIS的平均回收率在73.1%～80.2%之間，批內RSD在5.02%～7.49%之間。

丁雅韻等采用基質固相分散(MSPD)提取和凈化動物肝臟中的DES，洗脫液再過堿性硅藻土和硅膠SPE柱凈化。1.5mLKOH溶液(0.25mol/L)加入0.50g硅藻土中，劇烈振蕩，靜置15min，轉移到底部有篩板的固相萃取空柱中，在固相萃取裝置上用20mL甲苯-異辛烷(1+9，v/v)淋洗，抽干。MSPD洗脫液殘渣用100μuL甲苯和0.4mL異辛烷溶解并定量轉移到硅藻土柱上，用10mL甲苯-異辛烷(1+9，v/v)淋洗，抽干，用10mL水飽和的乙醚洗脫，收集洗脫液，N2吹干，再用100μL二氯甲烷-乙酸乙酯(1+1，v/v)溶解并定量轉移到硅膠柱上。硅膠柱已用5mL二氯甲烷-乙酸乙酯(1+1，v/v)和5mL正已烷活化。上樣后用5mL正己烷淋洗，5mL二氯甲烷-乙酸乙酯(1+1，v/v)洗脫，洗脫液N2吹干，衍生化后，進GC-MS測定。該方法LOD低于1μg/kg，回收率為81.6%～100.9%，RSD為8.7%～13.2%。

Yang等報道了豬肉、牛肉、蝦、牛奶和肝臟中的50種同化激素類(包括DIS、HES和DES)的殘留分析方法。采用GCB串聯NH2SPE柱對樣品進行了凈化。樣品經酶解和甲醇提取后，提取液用超純水稀釋，以3～5mL/min的速度過SPE柱凈化。GCB柱分別用6mL二氯甲烷-甲醇(70+30，v/v)、6mL甲醇和6mL水平衡。提取液全部通過GCB柱后，用1mL甲醇洗滌，真空抽干GCB柱，NH2柱用4mL二氯甲烷-甲醇(70+30，v/v)平衡后接在GCB柱下部，8mL二氯甲烷～甲醇(70+30，v/v)洗脫，洗脫液氮氣吹干，1mL甲醇-水(1+1，v/v)復溶后，LC-MS/MS檢測。該方法的LOQ為0.04～2.0μg/kg，平均回收率為76.9%～121.3%，CV為2.4%～21.2%。該研究同時比較了C18柱串聯NH2柱和HLB柱串聯NH2柱的凈化效果。結果發現，GCB-NH2、C18-NH2和HLB-NH2都可以取得滿意的回收率，但C18-NH2和HLB-NH2凈化會產生較強的基質抑制效應，DIS、HES和DES的基質抑制率為58%～88%，GCB-NH2凈化的基質抑制率為28%～36%。

B.RALs

強陰離子交換柱(MAX)、NH2柱等常被用于動物基質中RALs的凈化。

Xia等采用MAX柱凈化牛奶中的ZER、TAL、ZAN.ZON、a-ZOL和β-ZOL。在5mL牛奶中加入5mL乙腈，渦動30s，9000r/min離心5min(4℃)，取上清液，加入1.0mL氨水(2.5mol/L)和10mL水，混勻后過MAX柱(2mL乙腈和2mL水平衡)，2mL5%氨水和0.5mL乙腈洗滌，真空干燥2min，3mL乙酸-乙腈溶液(2+98，v/v)洗脫，50C水浴中氮氣吹干，0.5mL水-乙腈(50+50，v/v)復溶，過0.22um微孔濾膜后，LC-MS/MS分析。該方法平均回收率為92.6%～112.5%，CV低于11.4%，LOD和LOQ分別為0.01～0.05μg/L和0.05～0.2μg/L。錢卓真等利用NH2柱凈化水產品中的ZER、TAL、ZAN、ZON、a-ZOL和B-ZOL。樣品經乙腈提取，正已烷脫脂，下層乙腈溶液旋轉蒸發至干，乙腈飽和正己烷溶解備用。將NH2柱用5mL乙酸乙酯、5mL正己烷平衡。取提取液過柱，流速不超過1mL/min，再依次用5mL正已烷、5mL正已烷-乙酸乙酯(60+40，v/v)淋洗，4mL正己烷-乙酸乙酯(20+80，v/v)和4mL乙酸乙酯洗脫。洗脫液于50C下氮氣吹干，1mL乙腈-水溶液(20+80，v/v)定容，過0.22μum微孔濾膜后，LC-MS/MS分析。該方法LOQ為1.0lg/kg，回收率為75.9%～103.8%，RSD為3.90%～13.5%。

C.二苯乙烯類和RALs同時凈化

動物源基質中的二苯乙烯類化合物和RALs也可以采用SPE進行同時凈化。

Rubies等建立了SPE-LC-MS方法檢測動物尿液中的TAL、ZER、HES、DES和DIS等藥物。尿液酶解后用HLB固相萃取柱凈化，LC-MS/MS檢測。該方法的回收率為71.4%～106.4%；CCa為0.2～0.9ug/L，CCβ為0.3～1.0ug/L。Kathrin等2建立了采用SPE同時凈化牛尿中二苯乙烯類化合物(DES、DIS、HES)和RALs(ZER、TAL、a-ZOL、β-ZOL和ZON)的方法。5mL尿液樣品中加入2mL乙酸鈉緩沖液(2mol/L，pH5.2)，加入100μL蝸牛液(Helixpomatiajuice)，37℃避光放置16h或50℃放置3h，水解完成后用2mol/L氫氧化鈉溶液調pH9.0+0.1，5mL乙醚提取2次，旋轉蒸干，加入1.5mL甲醇和3mL水，2mL正已烷洗滌2次，棄掉正已烷層，過已用5mL甲醇和5mL水平衡的HLB柱(6cm3，200mg)，5mL甲醇和5mL甲醇-水(55+45，v/v)洗滌，5mL丙酮洗脫，洗脫液再過經5mL甲醇和5mL丙酮平衡的aminopropyl柱(500mg，3mL)，流出液蒸干后，用100μL乙腈-水(1+1，v/v)復溶，LC-MS/MS分析。該方法檢測二苯乙烯類化合物和RALs的LOD分別低于1μg/L和1.5μg/L，回收率分別為99.2%～106.0%和99.4%～107.9%。

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