牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量分析條件的選擇

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

9.2.2.7 分析條件的選擇

(1) 試樣制備

牛尿為液體樣品，可直接取10mL牛尿于50mL離心管中，3000r/min離心15min后，將尿液中少量懸浮物沉淀，取3mL上清液，加入含有玉米赤霉醇-4氘代和己烯雌酚-8氘代內標物的試管中，渦旋30s溶解混勻，即可。

(2)免疫親和柱凈化

本方法對比實驗了Euroclone公司和Randox公司兩種免疫親和柱。Euroclone公司的免疫親和柱對玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素同時吸附，操作較為簡單，但由于該柱的柱容量較小(玉米赤霉醇10ng，己烯雌酚10ng，己烷雌酚5ng，雙烯雌酚5ng)，用于多組分分析回收率的重現性較差。Randox公司的免疫親和柱分為玉米赤霉醇凈化柱和二苯乙烯類激素凈化柱兩種，該柱操作較前者略復雜，但柱容量較大(玉米赤霉醇100ng，己烯雌酚50ng，己烷雌酚50ng，雙烯雌酚50ng)，檢測靈敏度高，回收率重現性較好。因此，最終本實驗選擇了Randox公司的免疫親和柱。柱平衡、淋洗和被測物的洗脫，所用溶液以及流速控制，均按照Randox公司試劑盒中提供的使用操作說明書執行。

(3)質譜條件的優化

采用注射泵直接進樣方式，以5μL/min將玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚和雙烯雌酚的標準溶液分別注入串聯質譜的離子源中。一級質譜分析(Q1，母離子掃描)比較了電噴霧電離(ESI)的正方式和負方式，4種被測物均在負方式條件下得到了較高的響應值，確定了準分子離子峰(M-1)，優化了去簇電壓(DP)。對被測物的準分子離子碰撞后，進行二級質譜分析(MS2，子離子掃描)，得到子離子質譜圖，見圖9-3。對每種被測物選定的子離子進行碰撞氣能量(CE)的優化。在連接了液相色譜儀后，嘗試采用大氣壓化學電離(APCI)負方式進行測定，發現APCI(-)電離方式檢測靈敏度更高些。通過對APCI(-)條件下離子源溫度、霧化氣壓力、氣簾氣壓力、輔助氣1壓力、噴霧器電流等參數優化，以優化后本方法提供的參數對被測物進行檢測，玉米赤霉醇和己烷雌酚的方法最低檢出限可達0.25μg/kg，己烯雌酚和雙烯雌酚的方法檢出限為0.5μg/kg，可滿足日常檢測和殘留監控的玉米赤霉醇為0.5μg/kg，二苯乙烯類激素殘留為1μg/kg要求。

(4)HPLC條件的優化

玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素多采用C18柱進行分離，也有用C8柱的報道，但采用LC-MS-MS分析時，更多關注的是柱效和檢出限，而對分離度不作為重點。先后試用了Waters公司、Agilent公司、Merck公司等多個品牌的C18和C8柱，經比較Agilent公司的ZORBAXSB C8 (150mm×4.6mm，3.5um)對玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素的分析效果更好一些。

采用APCI電離時，乙腈為首選流動相，流速1mL/min。在此前提下試驗了不同流動相比例和梯度程序。由于流速較高，乙腈比例不宜低，最終選定乙腈-水=70+30。對比了不同梯度洗脫程序的分離結果，沒有明顯改善，因而選定了固定比例流動相。

9.2.2.8 線性范圍和檢測低限

配制玉米赤霉醇、己烷雌酚的濃度分別為1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL，己烯雌酚、雙烯雌酚的濃度分別為2.5ng/mL、5.0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL的混合標準溶液，以本方法的測試條件，進樣50μL進行測定，用經過內標校正的峰面積對標準溶液中各被測組分的濃度作圖，其各目標物在檢測范圍內均呈線性關系，線性方程和相關系數見表9-9。由于被測物均為禁用獸藥，因此，實驗以最低檢測限(MRL)的1/2為最低檢測，10倍的MRL為上限進行檢測。從表9-9數據可知，在此范圍被測物含量與質量色譜峰面積呈線性關系。

9.2.2.9 方法回收率和精密度

用不含玉米赤霉醇和己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚的牛尿樣品做添加回收和精密度試驗，樣品添加不同濃度標準后，按本方法進行樣品制備、凈化和測定，分析結果見表9-13。由表9-13結果看到，在相當方法檢出限0.25/0.50μg/kg，回收率為62.9%～117.6%，相對標準偏差為13.67%～21.63%；在方法限量0.5/1.0μg/kg，回收率為65.5%～119%，相對標準偏差為13.42%～24.19%。

表9-13 4種激素添加回收率實驗數據(n=10)

9.2.2.10 重復性和再現性

在重復性試驗條件下，獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不超過重復性限(r)，如果差值超過重復性限(r)，應舍棄試驗結果并重新完成兩次單個試驗的測定。在再現性試驗條件下，獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不超過再現性限(R)。被測物的含量范圍、重復性和再現性方程見表9-14。

表9-14 含量范圍及重復性和再現性方程

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