液相色譜-串聯質譜法測定牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

9.2.2.1 適用范圍

適用于牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量的液相色譜-串聯質譜法測定。方法檢出限：玉米赤霉醇和己烷雌酚為0.5μg/L；己烯雌酚和雙烯雌酚為1.0μg/L。

9.2.2.2 方法原理

免疫親和柱內含有的特異性抗體選擇性地與牛尿試樣中己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和玉米赤霉醇結合，形成抗體-抗原復合體，用水淋洗柱除去雜質，用洗脫劑洗脫吸附在柱上的目標物，收集洗脫液。試液用液相色譜-串聯質譜儀測定，保留時間和離子豐度比定性，內標法定量。

9.2.2.3 試劑和材料

甲醇、乙醇、乙腈：色譜純。

淋洗液：將Randox試劑盒中提供的淋洗原液用去離子水按1：20稀釋。

洗脫液：乙醇+水(70+30，v/v)。量取70mL乙醇與30mL去離子水混合。

儲備液：將Randox試劑盒中提供的儲備原液用去離子水按1：5稀釋。

激素標準物質：玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，各50%)純度≥97%；己烯雌酚，純度≥99%；己烷雌酚，純度≥98%；雙烯雌酚，純度≥98%。

激素標準溶液：分別準確稱取適量的玉米赤霉醇、己烯雌酚、已烷雌酚和雙烯雌酚標準物質，用甲醇配制成1.0mg/mL標準儲備溶液。再根據需要以甲醇配制成不同濃度的混合標準溶液作為標準工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用3個月。

內標標準物質：玉米赤霉醇-4氘代(包括Q-玉米赤霉醇-4氘代和β-玉米赤霉醇-4氘代，各50%)，純度≥99%；己烯雌酚-8氘代，純度≥98%。

內標標準溶液：準確稱取適量玉米赤霉醇-4氘代和己烯雌酚-8氘代標準物質，用甲醇分別配制成1.0mg/mL標準儲備溶液。再以甲醇稀釋成適用濃度的混合內標標準工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用3個月。

免疫親和層析柱：Randox(英國)或相當者；玉米赤霉醇免疫親和層析柱：親和柱的最大容量為100ng玉米赤霉醇；二苯乙烯免疫親和層析柱：親和柱的最大容量為50ng己烯雌酚，50ng己烷雌酚，50ng雙烯雌酚。

9.2.2.4 儀器和設備

液相色譜-串聯質譜聯用儀：配有大氣壓化學電離源；離心機：轉速大于3000r/min；氮氣濃縮儀；渦旋振蕩器。

9.2.2.5 樣品前處理

(1) 試樣制備

取有代表性樣品，制成實驗室樣品。試樣分為兩份，置于樣品瓶中，密封，并做上標記。將試樣置于2~8℃下保存。

(2) 樣品稱取

取5個陰性牛尿樣品，每個10mL，于50mL離心管中，3000r/min離心15min。向5支10mL試管中，分別加入不同量混合標準工作溶液，使玉米赤霉醇和己烷雌酚的濃度為1.25ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL；己烯雌酚和雙烯雌酚的濃度為2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分別加入適量混合內標標準工作溶液，使其濃度均為10ng/mL。加入3mL離心后牛尿的上清液，渦旋30s溶解，待凈化。

(3) 凈化

用15mL淋洗液分兩次預洗免疫親和層析柱，流速不大于3mL/min。上樣，自然流速。用5mL淋洗液以不大于2mL/min的速度淋洗，等體積重復淋洗一次，再用5mL去離子水以不大于2mL/min的速度淋洗。用4mL洗脫液洗脫，流速不大于2mL/min，收集洗脫液。將洗脫液在氮氣濃縮儀上于40℃水浴中吹干，加入1mL流動相，渦旋30s溶解。溶液經濾膜過濾后，供液相色譜-串聯質譜測定。

(4) 試樣溶液的制備

取經3000r/min離心15min后待測樣品3mL于50mL離心管中，加入內標標準工作溶液，使其含量均為2.0μg/kg。按上述步驟操作。

(5) 空白基質溶液的制備.

取經3000r/min離心15min后陰性樣品3mL于50mL離心管中，按上述步驟操作。

9.2.2.6 測定

(1) 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAXEclipseSB-C8，3.5μm，150mm×4.6mm，或相當者；柱溫；25℃；流動相：乙腈-水(70+30，v/v)；流速：1.0mL/min；進樣量：50μL。

(2)質譜條件

離子化方式：大氣壓化學電離；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監測(MRM)；離子源溫度：325℃；霧化氣壓力：15psi；氣簾氣壓力：10psi；輔助氣1壓力：35psi；噴霧器電流：-5μA；電噴霧電壓：-4500V；定性離子對、定量離子對、碰撞能量和去簇電壓見表9-4。

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