甾類(lèi)同化激素類(lèi)藥物殘留分析技術(shù)——前處理方法（四）

時(shí)間：2023-03-25 04:18:43來(lái)源：food欄目：食品快速檢測(cè) 閱讀：

甾類(lèi)同化激素類(lèi)藥物殘留分析技術(shù)——前處理方法（四）

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

(4)衍生化方法

由于ASs的沸點(diǎn)高不易揮發(fā)，通過(guò)化學(xué)衍生可以增加樣品的揮發(fā)度或提高檢測(cè)靈敏度，從而利于氣相色譜(GC)檢測(cè)，在ASs的殘留檢測(cè)中通常采用硅烷化和酰化等衍生法。而HPLC的化學(xué)衍生法則是在一定條件下利用化學(xué)衍生試劑或標(biāo)記試劑與樣品組分進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)物有利于檢測(cè)或分析。衍生化方法主要有：硅烷化法、酰化法、酯化法、鹵化法、環(huán)化法。

1)硅烷化衍生

硅烷化是ASs最普遍的衍生化方式，常用的硅烷化試劑有：三甲基硅烷(TMS)、雙(三甲基硅烷基)氟乙酰胺(BSTFA)、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)和N，O-雙(三甲硅基)乙酰胺(BSA)等。ASs結(jié)構(gòu)中凡含活潑氫原子基團(tuán)均可發(fā)生硅烷化反應(yīng)，如羥基、酚羥基、可烯醇化的酮基、氨基、羧基、硫酸等，生成TMS醚、TMS烯醇醚、TMS胺或TMS酯衍生物。一般還需加入催化劑以提高對(duì)位阻基團(tuán)的硅烷化能力。常用的催化劑包括疊氮基三甲基硅烷、N-三甲基咪唑(TMSim)、三甲基氯硅烷(TMCS)、三甲基碘硅烷(TMIS)和乙酸鉀。除乙酸鉀外，大部分催化劑自身也是硅烷化試劑。TMCS和TMIS可產(chǎn)生鹵酸，反應(yīng)液中需加入酸受體物質(zhì)，如吡啶等。目前，ASs殘留檢測(cè)主要采用MSTFA進(jìn)行硅烷化衍生。

Marchand等采用GC-MS檢測(cè)肉中的超痕量ASs。SPE洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸干后，通過(guò)液液分配將ASs分為兩類(lèi)：含D4-3-酮類(lèi)和酚結(jié)構(gòu)類(lèi)。D4-3-酮類(lèi)具體衍生條件：加入MSTFA-TMIS-DTT(1000+5+5，v/v/w)60℃孵育40min；酚結(jié)構(gòu)類(lèi)具體衍生條件：MSTFA-I2(1000+4，v/v)，室溫反應(yīng)，再用GC-MS測(cè)定。該方法測(cè)得23種ASs的LOD為5～100ng/kg。

Impens等建立了檢測(cè)腎脂肪和肉中雌激素、孕激素和雄激素殘留的GC-MS/MS方法。SPE洗脫液氮?dú)獯蹈珊螅捎肕STFA進(jìn)行衍生。將樣品轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)，氮?dú)獯蹈桑尤?5μL mSTFA渦動(dòng)混勻，進(jìn)行衍生后，用氣相色譜-離子阱-多級(jí)質(zhì)譜法(GC-IT-MSn)檢測(cè)。該方法測(cè)得雌激素、孕激素和雄激素的CCa為0.5～5ug/kg，CCβ為0.5～2.5ug/kg。

Yamada等報(bào)道了采用GC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)馬尿中多種蛋白同化類(lèi)固醇主要代謝物的方法。尿液經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶水解后，用Sep-Pak C18 PlusSPE柱凈化，洗脫液氮?dú)獯蹈珊螅尤氙B氮基三甲基硅烷，80℃衍生化反應(yīng)30min后，用GC-MS/MS在MRM模式下檢測(cè)。方法LOD為5～50ng/mL，平均回收率為71.3%～104.8%，CV為1.1%～9.5%。

Kootstra等建立了尿液中ASs多殘留檢測(cè)的GC-MS方法。該方法采用TMS進(jìn)行衍生，主要用于定性和半定量分析低劑量的ASs。衍生化條件為：加入30μL TMS，60℃孵育1h，衍生化產(chǎn)物氮?dú)獯蹈?60℃)，加入異辛烷超聲溶解后，GC-MS檢測(cè)。該方法在添加濃度為1μg/L時(shí)，測(cè)得ASs的CCa為0.06～0.77μg/L，CCβ為0.09～0.46μg/L；添加濃度為2μg/L時(shí)，測(cè)得ASs的CCa為0.26～0.54μg/L，CCβ為0.44～0.92μg/L，準(zhǔn)確度為92.6%～122.2%。

2)酰化衍生

酰化也是較為常用的衍生化方法，主要針對(duì)ASs的羥基、可烯醇化的酮基和氨基。衍生化試劑可分為三類(lèi)：酰氯、全氟代酸酐和含有活性酰基的化合物(如酰基咪唑)。常用的酰化試劑有七氟丁酸酐(HFBA)、五氟苯甲酰氯、N-甲基-雙-三氟代乙酰胺和三甲基乙酸酐等。酰化衍生物易于制備，一般將待測(cè)物溶于吡啶或四氫呋喃，加入過(guò)量的酰化劑即可。

曾東平等建立了豬肌肉中甲基睪酮、炔諾酮、17a-乙炔雌二醇、雌二醇、6a-甲基-17a-羥基孕酮、苯甲酸雌二醇和醋酸氯地孕酮等8種性激素殘留的GC-MS檢測(cè)方法。豬肌肉樣品經(jīng)過(guò)乙醚提取，氨基SPE柱凈化，濃縮后，加入50μL hFBA-丙酮(1+4，v/v)，于60℃靜置衍生反應(yīng)1h，再加入700μL甲苯和500μL雙蒸水，混勻離心后取上層供GC-MS檢測(cè)。在2.5～50μg/kg濃度范圍保持良好線性，相關(guān)系數(shù)大于0.97；在2.5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg添加水平下，8種性激素的回收率為67.7%～148%；方法LOD為0.94～2.41μg/kg，LOQ為3.13～8.03μg/kg。李青等采用乙醚和石油醚提取畜禽肉及內(nèi)臟中的雌二醇，在凈化、吹干的試樣殘?jiān)屑尤?mL衍生劑HFBA，超聲20min，氮?dú)獯蹈桑偌尤?.5mL異辛烷，混勻后GC-電子捕獲檢測(cè)器(ECD)檢測(cè)。方法LOD為0.5μg/kg，回收率為84.0%～93.0%。

我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T22967-2008、GB/T20749-2006分別檢測(cè)牛奶、奶粉中β-雌二醇?xì)埩袅亢团Ｄ蛑笑?雌二醇?xì)埩袅俊悠方?jīng)過(guò)β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸苷酶水解和HLBSPE柱凈化后，洗脫液氮?dú)獯蹈珊螅梦宸郊柞Ｂ扔?0℃衍生化15min，再用GC-MS測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。牛奶和牛尿的LOD均為0.25μg/kg，奶粉的LOD為2μg/kg，牛奶中回收率為84.1%～95.3%。

3)羥胺衍生化

羥胺衍生化又稱(chēng)為肟化。肟是含有羰基的醛、酮類(lèi)化合物與羥胺類(lèi)物質(zhì)作用生成的一類(lèi)化合物。羥胺衍生化是根據(jù)甾體類(lèi)激素的酮基可提供進(jìn)行親核加成部位的性質(zhì)，以羥胺類(lèi)物質(zhì)為衍生化試劑，將甾體類(lèi)激素的酮基在一定條件下與羥胺類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行親核加成反應(yīng)，生成肟類(lèi)物質(zhì)。常見(jiàn)的試劑如鹽酸羥胺、0-甲基羥胺、0-苯基羥胺、0-丁基羥胺、0-五氟芐基羥胺，生成肟或烷基肟，也常作為保護(hù)ASs酮基的方法。

Regal等建立了牛血清中雌激素的LC-MS/MS檢測(cè)方法。血清樣品經(jīng)乙腈提取和正己烷除脂，氮?dú)獯蹈桑缓笥?.5mol/L羥胺溶液(pH10)進(jìn)行羥胺衍生化，90℃反應(yīng)30min，衍生化產(chǎn)物用叔丁基甲醚提取，濃縮后復(fù)溶于甲醇-水中，最后用LC-MS/MS分析。方法CCa為6.00～19.46ng/L，CCβ為11.84～33.02ng/L。

4) 其他衍生方法

Athanasiadou等對(duì)增強(qiáng)ESI電離的化學(xué)衍生化方法進(jìn)行了綜述，具有很好的參考意義。以19-去甲雄酮為例，分別列舉了其羰基(圖8-4)、羥基(圖8-5)可發(fā)生的化學(xué)衍生化方法及衍生化產(chǎn)物。

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