β-受體激動劑殘留測定方法（二）

時間：2023-03-25 08:18:26來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

β-受體激動劑殘留測定方法（二）

[db:作者] / 2022-12-08 00:00

(4)生物傳感器技術(shù)(biosensor)

其原理為待測物與分子識別元件特異性結(jié)合后，所產(chǎn)生的復(fù)合物(或光、熱等)通過信號轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘枴⒐庑盘柕龋瑥亩_(dá)到分析檢測的目的。利用生物傳感器可檢測動物尿液、血清中β-受體激動劑的含量。肖紅玉等利用抗原抗體專一性結(jié)合而導(dǎo)致電化學(xué)變化的原理設(shè)計成了免疫生物傳感器，克倫特羅的檢出限為0.1ug/L，線性范圍為0.1～8.1ug/L，檢測時間在20min以內(nèi)。通過對100個已知陽性樣品和100個已知陰性樣品的測試，準(zhǔn)確率為97%

Chen等研制了以F0F1-ATP酶為動力蛋白的生物傳感器，測定食品中的克倫特羅。標(biāo)記F1300的內(nèi)色素細(xì)胞熒光探針被用作檢測由F0F1-ATP酶合成的ATP驅(qū)動的質(zhì)子通量的pH指示劑。此外，F(xiàn)0F1 ATP酶的Flβ亞基附著在“抗抗體-生物素-抗生物素蛋白-生物素-第二抗體(特異性針對克倫特羅)”系統(tǒng)，作為生物傳感器來檢測克倫特羅殘留。捕獲機(jī)理是抗原-抗體反應(yīng)，而檢測基于旋轉(zhuǎn)催化ATP合成過程中pH變化引起的熒光變化。結(jié)果表明，F(xiàn)0F1-ATP酶的活性受不同負(fù)載的影響，這種新的生物傳感器可用于超痕量(10-12 g/L)克倫特羅的檢測。該類方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、樣品前處理簡單、檢測迅速、攜帶方便、能重復(fù)利用并能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測和在線檢測等優(yōu)點(diǎn)。

(5)流動注射化學(xué)發(fā)光技術(shù)(flow injection-chemiluminescence，F(xiàn)I-CL)

Fl-CL的原理是基于把一定體積的液體試樣注射到一個運(yùn)動著的、無空氣間隔的由適當(dāng)液體組成的連續(xù)載流中。被注入的試樣在向前運(yùn)動過程中由于對流和擴(kuò)散作用而分散成一個個具有濃度梯度的試樣帶，試樣帶與載流中某些組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生某種可以被檢測的物質(zhì)，然后被載帶到檢測器中連續(xù)記錄其吸光度、電極電位或其他物理參數(shù)。試樣流過檢測器的流通池時，這些參數(shù)連續(xù)地發(fā)生變化。典型的檢測儀輸出信號呈峰形，其高度或面積與待測物濃度有關(guān)。陳麗莉等設(shè)計了一種快速檢測豬肉中鹽酸克倫特羅的Fl-CL免疫分析方法。由辣根過氧化物酶(HRP)催化的魯米和過氧化氫-尿素加合物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可通過4-聯(lián)苯硼酸得到增強(qiáng)。在競爭性免疫反應(yīng)后，上清酶標(biāo)復(fù)合物由FI-CL法進(jìn)行檢測。在優(yōu)化條件下，測定克倫特羅的線性范圍為0.05～9ug/L(r=0.9959)，檢出限為0.02μg/L。該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于豬肉中克倫特羅殘留的檢測。

(6)色譜技術(shù)(chromatography)

色譜作為一種高效分離分析技術(shù)，是目前β-受體激動劑殘留分析中應(yīng)用最廣的分析手段，主要包括氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳法(CE)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)等。

1)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是近年來發(fā)展較快的β-受體激動劑殘留分析技術(shù)之一。采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度的檢測器，具有重現(xiàn)性好、分離效率高等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)合紫外檢測器(UVD)、二極管陣列檢測器(DAD)、熒光檢測器(FLD)、電化學(xué)檢測器(ECD)等，對β-受體激動劑的檢測限可以達(dá)到ug/kg級別。

Miyazaki等采用HPLC-UVD檢測動物組織中克倫特羅，采用ODS柱分離，0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH3.5)-乙腈(7+3，v/v)為流動相，流速0.9mL/min，在209nm或242nm檢測，測定低限為5ng/g，回收率為75.1%～86.4%。Tsai等采用HPLC-DAD檢測豬血漿和組織中的克倫特羅和沙丁胺醇?xì)埩簟ova-pak C18色譜柱分離，沙丁胺醇流動相為乙腈-水(15+85，v/v)，克倫特羅流動相為乙腈-水(30+70，v/v)，流速1.0mL/min，檢測波長210nm(克倫特羅)和196nm(沙丁胺醇)。克倫特羅和沙丁胺醇的檢測低限分別為0.2uL/L和0.1uL/L；血漿中沙丁胺醇的平均回收率為86.7%，克倫特羅為80.0%；肌肉中沙丁胺醇的平均回收率為64.2%，克倫特羅為62.9%。

Hashimoto等采用HPLC-FLD檢測肉中的沙丁胺醇。在ODS柱(TSKgel-ODS80Ts)上分離，流動相為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH3.0)-乙腈(92+8，v/v)，激發(fā)波長為225nm，發(fā)射波長為310nm。方法測定低限為5ng/g，在100ppb添加水平的回收率為77.6%～81.5%。

安洪澤等采用反相HPLC-UVD-FLD法測定豬飼料中克倫特羅、沙丁胺醇、非諾特羅、萊克多巴胺和班布特羅。在C18色譜柱上，以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速1mL/min，UVD檢測波長249nm(克倫特羅)，F(xiàn)LD激發(fā)波長226nm、發(fā)射波長306nm(沙丁胺醇、非諾特羅、萊克多巴胺和班布特羅)進(jìn)行串聯(lián)檢測。方法檢測限(LOD)為20ug/kg，LOQ為50ug/kg，平均回收率范圍為86.7%～103.5%，CV范圍為1.5%～9.5%。

一些β-受體激動劑具有電化學(xué)活性，可在電極上發(fā)生氧化反應(yīng)，可采用ECD檢測，來提高靈敏度。Turberg等采用HPLC-ECD檢測了豬血清和猴血漿中萊克多巴胺殘留。HPLC采用等度洗脫，電壓為+700mV，運(yùn)行時間6.5min。方法線性范圍為0.5～40ng/mL，LOQ為2ng/mL。Zhang等采用HPLC-庫侖電極檢測系統(tǒng)對豬肝中的克倫特羅殘留情況進(jìn)行分析。四個電極串聯(lián)使用，電位分別為450mV、600mV、650mV和680mV，從而避免了其他ECD檢測中β-受體激動劑能在高電位作用下被不可逆的氧化的缺點(diǎn)，提高了HPLC的選擇性和精密度。同時，研究了流動相pH對保留時間和峰高的影響和克倫特羅在石墨電極上的電化學(xué)行為。該方法線性良好，檢測限為1.2ng/g。

2)氣相色譜法(gas chromatography，GC)

GC與電子捕獲檢測器(ECD)、氮磷檢測器(NPD)、氫火焰離子化檢測器(FID)等結(jié)合，檢測β-受體激動劑具有檢測精密度高、分離度好，能分離其同位素、同分異構(gòu)體、對映體等優(yōu)點(diǎn)，但也具有樣品需要衍生化，不能定性等缺點(diǎn)。

用GC測定β-受體激動劑通常需要衍生化來提高檢測靈敏度，最常用的衍生化技術(shù)是硅烷化技術(shù)，常用的衍生化試劑是雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)。盡管有用環(huán)狀二甲基硅烷嗎啉(DMS)、甲基硼酸(MBA)等作為衍生化試劑的報道，由于其使用有一定的局限(如對特布它林無法生成衍生物)，而限制了使用范圍。采用BSTFA進(jìn)行衍生化反應(yīng)如圖1-2。

圖1-2 β-受體激動劑與BSTFA的衍生化反應(yīng)

崔曉明等建立了GC分析動物組織中鹽酸克倫特羅殘留量的方法。采用固相萃取分離富集動物組織中的鹽酸克倫特羅，經(jīng)BSTFA衍生化后用GC-ECD檢測，以外標(biāo)法多點(diǎn)校準(zhǔn)定量。測得動物組織中克倫特羅的峰面積與樣品濃度在0.005～1.0ug/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999，肉樣的加標(biāo)回收率在70%～80%，最低檢出限為1ug/kg。謝維平等采用厚膜非極性柱對未經(jīng)衍生化的克倫特羅直接分離，用NPD檢測，分離峰形良好，平均回收率為86.0%，RSD為5.0%，相關(guān)系數(shù)為0.9993，線性范圍為0.1～40.0mg/L，檢測限為0.03mg/L。黃盈煜等提取內(nèi)臟組織中的克倫特羅后，用乙酸酐衍生化，再采用GC-NPD檢測。該方法線性范圍為5～250ug/kg，最小檢測濃度為0.011ug/mL。Engelmann等采用固相微萃取(SPME)提取凈化樣品中的克倫特羅，在進(jìn)樣口硅烷化衍生后，用GC-FID測定其六甲基二硅衍生物，檢測靈敏度可以達(dá)到1.1ppb。

3)毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis，CE)

CE具有分離效率高、分析速度快、重現(xiàn)性好、樣品和試劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，同時具有很大的操作靈活性，許多分離參數(shù)如緩沖液的組成、pH、毛細(xì)管的類型、所用電場的波形等都可以調(diào)節(jié)，分離效率可達(dá)幾百萬理論塔板數(shù)，被視為高效的分離技術(shù)之一。Gausepohl等利用CE-UVD來檢測尿樣中克倫特羅對映體的殘留情況。樣品用己烷-叔丁基甲基醚(99.5+0.5，v/v)提取后，電動注射進(jìn)樣(50s，10kV)，磷酸鹽緩沖液(pH3.3)和羥乙基-β-環(huán)糊精作為手性選擇劑。整個分析時間小于15min，以S-(-)-布拉洛爾為內(nèi)標(biāo)，克倫特羅對映體的檢測限為0.5ng/mL。管月清等采用CE-ECD法測定了肉制品中克倫特羅和沙丁胺醇的含量。考察了緩沖液酸度和濃度、分離電壓、氧化電位和進(jìn)樣時間等實(shí)驗(yàn)參數(shù)對分離檢測的影響，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，工作電極為直徑300um的碳圓盤電極，檢測電位為+950mV(vs.SCE)，緩沖液為40mmol/L硼砂溶液(pH7.4)，分離電壓18kV，在8min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)二者的分離，且在兩個數(shù)量級的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，LOD分別為1.11×107mol/L和9.80×103mol/L，且抗壞血酸對其檢測不產(chǎn)生干擾。

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