氯霉素類藥殘留測定——免疫分析法（一）

時間：2023-03-25 07:20:16來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

氯霉素類藥殘留測定——免疫分析法（一）

[db:作者] / 2022-12-09 00:00

(2)免疫分析法(immunoassay， IA)

基于抗原與抗體特異性反應的免疫分析技術，一直是獸藥殘留快速檢測和樣品篩選方法的研究熱點。CAPs的二氯酰胺醇和硝基苯結構與大分子蛋白結合后可作為完全抗原，并有效制備相應的抗體。從20世紀80年代后期開始，免疫法在眾多的CAPs殘留檢測方法中發展迅速。免疫法主要包括酶聯免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、膠體金免疫層析法(GICT)、免疫傳感器(IS)、熒光免疫分析法(FIA)等。其中，使用最普遍的是ELISA方法。

1)酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)

ELISA作為篩選方法，樣品處理簡單，樣品通量大，檢測成本低，不需復雜儀器設備，與一般儀器方法相比，檢測限更低，且選擇性高。因此，ELISA方法在現場監控和日常大批量檢測工作中有著廣闊的應用前景。

Campbell等于1984年率先報道了采用競爭ELISA方法檢測CAP殘留。采用市售的酶聯抗兔免疫球蛋白抗體和添加底物，樣品中游離的CAP和固定在固相上的CAP與特異性兔抗體競爭性結合，酶活性與樣品中CAP的濃度成反比，用分光光度法測定。整個分析過程小于24h。該ELISA方法的定量范圍在1～100ng/mL之間；對琥珀酸CAP和TAP具有交叉反應。何方洋等用重氮化方法將CAP與牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶聯，制備免疫抗原和包被抗原，ELISA鑒定。將偶聯抗原用弗氏佐劑乳化后免疫兔子，制備多克隆抗體，硫酸銨沉淀法初步純化，親和層析法進一步純化。建立競爭ELISA法檢測CAP，方法LOD為0.3ng/mL。魏書林等利用活化酯法合成CAP抗原，作為免疫原免疫兔子得到CAP的單克隆抗體，建立了CAP間接競爭ELISA方法。結果顯示抗體效價可達1：640000，半數抑制劑濃度(IC50)為1.3ng/mL，LOD達到0.05ng/mL，線性檢測范圍為0.1～36.45ng/mL，在0.5ng/g、1ng/g、2.5ng/g、5ng/g添加濃度水平，雞肌肉組織中的回收率為55.4%～119%。

Tao等開發了一種競爭性的間接化學發光酶聯免疫分析方法(CL-ELISA)，檢測牛奶和雞肉中CAP殘留。由于該多克隆抗體的獨特特性，特殊反應系統和改進提取方法，優化條件后(吐溫-20的濃度，PB的濃度和pH，溫育時間和溫度)，方法LOD可達到0.92ng/L，定量范圍在3.16～3035ng/L之間，IC50為17.29ng/L。牛奶和雞肉中的回收率分別為104.9%～114.8%和101.0%～118.8%，CV為3.0%～14.6%和9.5%～14.4%。該作者又建立了一種高靈敏度的化學發光酶免疫測定方法(CLEIA)測定牛奶中的CAP。在優化條件下，在增強劑：3(10-吩噻嗪基)丙烷-1-磺酸鹽(SPTZ)和4-嗎啉(MORP)的存在下，通過辣根過氧化物酶(HRP-C)催化化學發光反應(ECR)。該HRP化學發光的LOD為0.33pg/孔。結果證明，這種新的增強劑可以顯著提高HRP催化的ECR的光輸出，提高檢測靈敏度。Jiang等也開發了牛奶、奶粉、蜂蜜、雞蛋和雞肉中CAP的CL-ELISA方法。方法LOD為0.7ng/L，定量范圍在2.1～92.4ng/L之間，IC50為13.6ng/L，靈敏度顯著優于傳統的ELISA方法。在5～60ng/L添加濃度，方法回收率為72.1%～116.0%，CV為4.2%～20.2%。

Wu等開發了間接競爭ELISA方法檢測動物可食組織中的FFa。FFa通過戊二醛法共價連接到載體蛋白上作為免疫原，免疫獲得多克隆抗體。該抗體的IC50為3.34μg/L。樣品用乙酸乙酯-氫氧化銨(90+10，v/v)提取后，用該ELISA方法檢測。豬肉、雞肉和魚的LOD分別為3.08ug/kg、3.3ug/kg和3.86ug/kg，回收率在64.6%～124.7%之間，CV為11.3%～25.8%。

部分已發表的CAPs的ELISA方法見表4-3。

表4-3 部分動物源產品中CAPs的ELISA檢測方法

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