四環素類藥物殘留分析技術——前處理方法（二）

時間：2023-03-25 01:52:04來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

四環素類藥物殘留分析技術——前處理方法（二）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(2)凈化方法

目前國內外有關生物樣品中TCs殘留的樣品凈化方法主要有固相萃取(SPE)、磁性固相萃取(MSPE)、固相微萃取(SPME)、基質固相分散(MSPD)、分子印跡技術(MIT)、限進介質(RAM)、金屬螯合親和層析(MCAC)等技術。

1)固相萃取(solidphaseextraction，SPE)

SPE不需要大量有機溶劑，不產生乳化現象，可凈化很小體積的樣品，被廣泛用于分離和凈化樣品中的TCs。SPE柱通常選擇基于反相保留機理的HLB、C18、Strata-X凈化，也有采用基于陰離子交換機理的SAX、MAX等，此外還可聯合用柱，以提高凈化效果。

Peres等采用C18 SPE柱凈化蜂蜜中的OTC、TC和CTC。3g蜂蜜中加入15mL 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH4.0)提取，C18 SPE柱分別用5mL甲醇和5mL 0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液平衡，5mL樣品上樣通過SPE柱，2.5mL mellvaine緩沖液-甲醇(85+15，v/v)和2.5mL水洗滌，減壓干燥2min，2.5mL乙腈再次洗滌，減壓干燥1min，3.0mL乙酸乙酯-甲醇(75+25，v/v)洗脫，30～35℃水浴中氮氣吹干，1mL甲醇-水(15+85，v/v)復溶，過濾后HPLC檢測。方法的回收率為86%～111%，CV低于11%，LOD和LOQ分別為8μg/kg和25μg/kg。由于TCs容易與金屬離子整合，一般采用EDTA對SPE柱進行預處理，可以有效避免TCs在SPE柱的損失，提高回收率。Suarez等采用多壁碳納米管(MWNTs)吸附凈化水樣中的TCs，并與毛細管電泳-質譜(CE-MS)串聯分析，方法LOD在0.30～0.69μg/L之間，回收率為98.6%～103.2%。Aoyama等報道，未經EDTA處理的C18柱由于硅膠基表明的硅烷醇基的存在及殘余的金屬離子易與TCs結合，而影響凈化效果和回收率，將EDTA加入上樣液中或預處理SPE柱，則可以獲得較好效果。以聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS/DVB)為填料的反相柱與烷基鍵合硅膠柱相比，PS/DVB填料本身具有疏水性和可再生性，不需要鍵合烷基鏈，因此不存在TCs與殘余硅羥基結合產生的峰形拖尾現象。Blasco等采用HLB固相萃取柱凈化牛、豬、家禽和羔羊肌肉組織中的CTC、TC、OTC和DC。方法以水為提取溶液，ASE提取，提取液經HLB固相萃取柱凈化，5mL甲醇和5mL水活化，提取液過柱后，2mL甲醇-水(95+5，v/v)洗滌，2mL甲醇洗脫(10mmol/L甲酸酸化)，洗脫液吹干，1mL甲醇-水(50+50，v/v)復溶，LC-MS/MS檢測。方法平均回收率高于89%，日內和日間CV分別低于15%和17%，LOQ為0.5～1.0μg/kg，CCa和CCβ分別為101～116μg/kg和112～130μg/kg。Koesukwiwat等采用HLB柱凈化牛奶中的3種TCs，回收率在72.01%～97.39%之間，RSD小于11.08%。Andersen等也采用HLB柱凈化蝦和牛奶中的TC、OTC和CTC，回收率超過75%，RSD小于10%。Xu等則采用HLB柱凈化蜂王漿中的TC、OTC、CTC和DC，方法回收率在62%～115%之間，CV為3.4%～16.3%。Wang等采用Strata-XSPE柱凈化蜂蜜中的OTC、TC、CTC和DC。5g蜂蜜用15mL 0.1mol/L乙酸鈉溶液(pH4.5)稀釋，攪拌器1000r/min攪拌5min，過濾后過SPE柱(10mL甲醇、10mL水和10mL 0.1mol/L乙酸鈉溶液平衡)，SPE柱真空干燥5min，5mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液40℃旋轉蒸干，0.25mL甲醇-0.01mol/L鹽酸溶液(20+80，v/v)復溶，HPLC檢測。方法的回收率為95.3%～103.5%，CV低于2.79%，LOD為2.12～5.12μg/mL。

龐國芳等比較了單一固相萃取柱凈化(OasisHLB)和雙柱凈化(HLB和Carboxylic acid陰離子交換柱)禽肉中OTC、TC、CTC、DC的效果。禽肉樣品用0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH4)提取，提取液以不超過3mL/min的流速通過HLB固相萃取柱，5mL甲醇-水(5+95，v/v)洗滌，減壓抽干20min，15mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液在減壓下以不超過3mL/min的流速通過Car-boxylicacid陰離子交換柱，5mL甲醇洗柱，減壓抽干5min，4mL乙腈-甲醇-0.01mol/L草酸溶液(2+1+7，v/v)洗脫于5mL樣品管中，定容至4mL，紫外檢測器于350nm測定。在5～100μg/kg添加水平，方法回收率為60%～100%，RSD在16%以內；OTC、TC的LOD為2μg/kg，CTC、DC的LOD為5μg/kg。實驗發現，單獨使用HLB柱凈化，在4.3min、4.9min、5.5min和8.2min均有比較大的干擾峰存在，當OTC、TC、CTC、DC含量小于0.010mg/kg，對檢測結果均有影響，而采用HLB和Carboxylicacid陰離子交換柱雙柱凈化，從4min到18min之間均無干擾峰，改進了凈化效果，減少了基質干擾，提高了方法的準確度。Jia等B3采用HLB和MAX柱聯合凈化水樣中的6種TCs及其10種代謝物。經MAX凈化后，LC-MS/MS色譜峰出峰范圍內的干擾峰消失，方法回收率為34%～113%，LOD為0.8～17.5ng/L。

2)磁性固相萃取(magnetic solid phase extraction，MSPE)

MSPE是一種以磁性或可磁化的材料作吸附劑基質的一種固相萃取技術。在MSPE過程中，磁性吸附劑不直接填充到吸附柱中，而是被添加到樣品的溶液或懸浮液中，將目標分析物吸附到分散的磁性吸附劑表面，在外部磁場作用下就可使目標分析物與樣品基質分離開來。與普通的SPE技術相比，MSPE萃取過程簡單化，不需要昂貴的設備，化學物質的使用量大為減少，且沒有二次污染產生。MSPE不僅能萃取溶液中的目標分析物，還能萃取懸浮液中的目標分析物，且由于樣品中的雜質一般都是反磁性物質，能有效地避免雜質的干擾。因此，MSPE被人們越來越多的應用于環境、食品、生物、醫藥等領域中樣品的分離和富集。

Rodriguez等采用MSPE方法凈化牛奶中的CTC、TC、OTC，牛奶樣品直接經MSPE凈化，酸化甲醇洗脫。在50mL牛奶中加入0.3g硅烷化磁性SPE填料，攪拌20min使均勻分散，靜置5min，用磁鐵分離硅烷化磁性填料，10mL的EDTA(1mmol/L)洗滌，3×1.5mL乙酸甲醇溶液(1mmol/L)洗脫，取0.5mL洗脫液，加入0.5mL的EDTA溶液(1mmol/L)，硼酸鹽緩沖劑稀釋至10mL，紫外-可見分光光度計540nm檢測。方法的線性范圍為0.03～0.60mg/L，LOD為10μg/L，平均回收率為91.0%～97.0%，CV低于5%。

3)固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)

SPME的選擇性是根據“相似相溶”原理，結合被測物的極性、沸點和分配系數，通過選用具有不同涂層材料的纖維萃取頭而實現的。SPME-HPLC技術已經在涂層材料和操作方式兩方面獲得了較大的發展，在操作方式上，除最初的手動SPME-HPLC繼續獲得發展外，管內SPME-HPLC(in-tube-SPME-HPLC)等新開發的操作方式也取得很快發展。

Wen等以生物相容性的聚合整體毛細管柱作為吸附媒介，利用在線管內SPME-HPLC對魚肉中CTC、TC、OTC和DC進行分析檢測。取1.0g鯽魚肌肉樣品，加入10mL 0.01mol/L的EDTA-Macllvaine緩沖液(pH4.0)，手動混合10min，4℃避光靜置30min，12000r/min離心5min，上清液SPME凈化，HPLC檢測。在100～10000ng/g濃度范圍內抗生素的線性關系良好，LOD為16～30ng/g，回收率為68.1%～75.9%，日內和日間CV分別低于4.22%和5.71%。整體毛細管由于增大了與樣品溶液的接觸面積，使目標物的提取效率更高，樣品前處理簡便快捷，無需處理魚肉中的蛋白和脂肪。Hu等以TC為模板，合成了分子印跡聚合物(MIPs)，涂層SPME纖維，用以凈化雞肉和牛奶中的痕量TC、OTC、DC和CTC，并采用在線HPLC方法檢測。方法回收率均超過71.6%，LOD在1.0～2.3μg/L之間。Tsai等報道了采用分散固相微萃取(dispersive-SPME)凈化奶中TC、OTC、CTC和DC的方法。作者發現，基于硅膠的吸附劑，尤其是用伯胺、仲胺或羰基官能化的，在有機環境下，其吸附容量比聚合物吸附劑更高。用乙腈萃取，并加鹽促進分配后，TCs用少量的伯胺和仲胺硅膠吸附劑吸附，解吸后用HPLC檢測。方法回收率為97.1%～104.1%，LOD在7.9～35.3ng/g之間。

4)金屬螯合親和層析(metal chelate affinity chromatographic，MCAC)

MCAC是將吸附材料經CuSO4溶液處理，含有TCs的提取液經MCAC凈化，TCs與結合在瓊脂凝膠柱上的Cu整合而被專一性地吸附在柱填料上，再以EDTA-Mcllvaine緩沖液洗脫，達到與其他雜質分離的目的。

Stubbings等利用在線MCAC-HPLC檢測動物組織中的TCs殘留。25uL CuSO4溶液(50g/L)和500μL純水活化MCAC柱，提取液以0.36mL/min流速上樣，500uL純水、500μL甲醇、500μL純水分別洗滌，KH2PO4-EDTA-Mcllvaine緩沖液洗脫，KH2PO4-EDTA-Mcllvaine緩沖液-甲醇-乙腈和KH2PO-EDTA-Mllvaine緩沖液分別平衡以再生MCAC柱。方法檢測OTC和TC的LOD為10μg/kg，檢測CTC和DMCT的LOD為20μg/kg，回收率為50%～80%。Cooper等報道了采用在線MCAC-HPLC測定動物組織和雞蛋中TCs的方法。用乙酸乙酯提取，蒸干后用甲醇復溶，在線MCAC-HPLC檢測。當添加濃度為25ug/kg時，TC、OTC、CTC和DMCT的回收率在42%～101%之間，LOD優于10ug/kg。Croubels等用琥珀酸鈉緩沖液和甲醇均質提取動物組織和雞蛋樣品中的TCs，離心后，MCAC凈化，再經陽離子交換萃取膜富集后，HPLC檢測。TCs的回收率為40%～70%，RSD小于10%；LOD在0.42～1.38ng/g之間，LOQ在2～5ng/g之間。

5)基質固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是將樣品與C18、氧化鋁等吸附劑一起混合研磨，使樣品均勻分散于固定相顆粒表面，制成半固態后裝柱，然后選擇合適的洗脫劑洗脫。MSPD技術濃縮了傳統樣品前處理中勻漿、提取、凈化等過程，避免了待測物在這些過程中的損失，具有提取凈化效率高、節省溶劑、樣品用量少等優點。

張素霞等建立了牛奶中CTC、TC、OTC和DC殘留的MSPD提取和凈化方法。稱取22g C18填料，裝入50mL玻璃注射器，分別用兩倍柱體積的正己烷、二氯甲烷和甲醇依次洗滌，真空干燥；稱取2g干燥后的C18填料置于玻璃研缽中，分別加入0.05g Na2EDTA和草酸，將0.5mL牛奶樣品加至C18填料上，用玻璃杵輕輕研磨30s，使樣品與填料均勻混合，取5mL玻璃注射器，下端墊一片濾紙，加無水硫酸鈉至0.2mL體積，將樣品裝入，上墊一片濾紙，壓至體積為4.2mL；用8mL正已烷洗滌，真空抽干后用乙酸乙酯-乙腈(1+3，v/v)洗脫于雞心瓶中，加0.1mL乙二醇，用旋轉蒸發儀除去溶劑，殘留物用0.4mL甲醇-乙腈-0.01mol/L草酸(2+3+5，v/v)溶解，渦動混合15s，轉至玻璃離心管中，2000g離心10min；取上清液進樣，HPLC測定。方法的平均回收率為78.7%～90.2%，CV在2.4%～1.18%之間，LOD為0.02～0.05μg/mL。Mu等分別采用硅酸鎂(Florisil)、硅膠和C18作為MSPD吸附劑，建立了牛奶中TC、OTC和DC的殘留方法。將吸附劑與牛奶樣品按4：1混合后裝入注射器，用6mL正己烷洗滌脫脂，6mL 0.1mol/L檸檬酸水溶液-甲醇(1+9，v/v)洗脫，洗脫液氮氣吹干，0.5mL甲醇復溶，0.45um濾膜過濾，CE分析。結果顯示，采用C18的回收率最高，平均回收率為93.4%～102%，LOD為0.0745～0.0808μg/mL。

6)分子印跡技術(molecular imprinting technology，MIT)

MIT是通過化學手段人工合成的高分子仿生材料。在目標分子(模板分子)的存在下交聯聚合，然后洗脫除去模板分子，在立體空穴和作用位點上與模板分子具有互補的結構，又具有模板分子可回收重復使用的優點，因此在分子識別中有著特殊的選擇性。

李倩等用沉淀聚合的方法以DC為模板分子合成對TC、OTC、CTC具有特異性識別的MIPs。1mmoL鹽酸強力霉素、60mL乙腈、8mmoL甲基丙烯酸(MAA)、16mmoL三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和45mg偶氮二異丁腈(ABIN)混合，通氮除氧后，60℃磁力攪拌反應24h，獲得MIPs。識別性能和物理特性驗證表明，該MIPs對TCs有特異性吸附作用，并具有良好的穩定性。以該MIPs作為填料制備SPE小柱，凈化條件為：5mL甲醇活化，10mL水溶液上樣，3mL 5%甲酸水溶劑淋洗，6mL 1%甲酸-甲醇溶液洗脫。該小柱最大載樣量為0.2mg，平均回收率為72.31%～90.85%，CV低于10%。Sun等以TC作為模版，MAA為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯劑，甲醇為溶劑，環己醇和十二烷醇作為混合致孔溶劑，首次采用原位MIT技術制備了TC印跡整體柱，并對合成條件和性能進行優化和評估。該整體柱與C18 SPE柱連接，被用于牛奶和蜂蜜中TCs的凈化，方法回收率在73.3%～90.6%(牛奶)和62.6%～82.3%(蜂蜜)之間。Hu等以TC為模板，丙烯酰胺為功能單體通過三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯合成MIPs，涂層SPME纖維，采用在線HPLC檢測雞肉和牛奶中的痕量TC、OTC、DC、CTC。方法回收率均超過71.6%。實驗與用普通涂層得到的回收率進行了比較，結果MIPs涂層對TCs的提取效果令人滿意。

7)限進介質(restricted access materials，RAM)

RAM也稱為限制進入固定相，是一種新型在線樣品預處理填料，同時兼具分離和富集功能，通過控制填料的孔徑和對其外表面進行親水性修飾，使得親水性外表面與生物樣品中大分子物質不發生不可逆的變性和吸附，進而在死體積或近于死體積的情況下被洗脫除去。具有避免被分析物由于前處理所造成的損失，減少傳統生物樣品制備時的繁瑣步驟，節省人力和物力且易于實現自動化等優點。Chico等將二醇基鍵合在多孔硅膠孔外表面，Cs烷基鏈鍵合在內表面作限進介質材料，在線RAM-HPLC檢測牛奶中TCs。以Mg(NO3)2·6H2O作為柱后衍生試劑，測得牛奶的CV為6%～9.2%；方法提高了分析物的可檢測性，但所測OTC、TC的回收率僅為50%和67%。

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