四環(huán)素類藥物殘留分析技術(shù)——測定免疫分析法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

(2)免疫分析法(immunoassay，IA)

免疫分析法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，免疫分析技術(shù)最突出的優(yōu)點是操作簡單，速度快、分析成本低。TCs殘留分析主要采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、膠體金免疫層析法(GICA)和放射免疫分析法(RIA)。

1)酶聯(lián)免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA是可以對大批樣本進(jìn)行定性、定量測定的方法，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、快速的特點。

Jeon等采用生物素與親和素介導(dǎo)的競爭性ELISA分析牛奶中的TC將TC與卵清蛋白偶聯(lián)制備羊抗TC多克隆抗體，結(jié)果LOD為0.048ug/L。使用該法處理的樣品無需凈化和稀釋，結(jié)果靈敏度高，并且所測的幾種物質(zhì)未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。Zhang等合成三種新的免疫源制備兔抗TC多克隆抗體，建立間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(ic-ELISA)，添加回收率為74%～116%，新免疫原的合成可為牛奶中TCs殘留檢測提供新的篩選方法。Lee等采用半定量ELISA測定豬血漿中的OTC、CTC和TC含量。

Pastor-Navarro等合成TCs的酰胺和重氮衍生物選擇性半抗原，制備多克隆抗體，篩選蜂蜜中殘留TCs，LOD為0.4ng/mL，回收率達(dá)到79%～108%。該法提供了一步合成半抗原的新途徑，但物質(zhì)的交叉反應(yīng)均超過10%。Jeon等報道了基于生物素抗生物素介導(dǎo)的ELISA方法，測定蜂蜜中的TC。用pH7.2的PBS-EDTA測定緩沖液配置和稀釋TC標(biāo)準(zhǔn)品，不需要任何前處理，直接ELISA測定。方法LOD為0.19μg/L，LoQ為0.38μg/L，回收率為95%～101%，與結(jié)構(gòu)相似物沒有發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。

Le等基于金霉素-牛血清白蛋白(CTC-BSA)作為免疫原產(chǎn)生的單克隆抗體建立了快速、靈敏測定動物組織中CTC殘留的ELISA方法。改進(jìn)的ELISA方法中半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.66ng/mL。雞肉和雞肝中CTC的添加回收率范圍分別為78.8%～92.2%和80.3%～90.2%，CV分別為3.2%～9.5%和6.5%～10.2%；LOD分別為0.06ng/g和0.07ng/g。該作者還應(yīng)用高靈敏度和特異性單克隆抗體建立了改進(jìn)的ic-ELISA測定雞肉和雞蛋中DC殘留。應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備DC單克隆抗體，測定靈敏度、特異性，精密度和準(zhǔn)確度等參數(shù)對改進(jìn)的ic-ELISA方法進(jìn)行了評價。在最佳實驗條件下，在0.01～100ng/mL范圍內(nèi)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，IC50值為(1.32±0.18)ng/mL，LOD為(0.14±0.02)ng/g；添加水平為50～600ng/g時，雞肝、雞肉和雞蛋中DC的回收率分別為84.6%～85.5%、88.2%～89.1%和84.4%～～89.3%，CV分別為5.1%～9.3%、3.7%～11.3%和4.7%～9.8%。

2)膠體金免疫層析法(colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)

GICA因其快速、簡便、靈敏度高的優(yōu)點成為近幾年用于牛奶、雞蛋中TCs殘留檢測的新方法。

檀尊社等建立了快速檢測水產(chǎn)品中TCs殘留的GICA方法。采用競爭模式，將抗TC單克隆抗體-膠體金復(fù)合物包被在膠體金結(jié)合墊上，并將人工合成的TC抗原包被在硝酸纖維素薄膜表面作為檢測線，殘留藥物與待測樣品中TC競爭結(jié)合膠體金標(biāo)記的TC單克隆抗體，以顏色直觀顯示檢測結(jié)果。試劑靈敏度最低值可達(dá)100ng/mL，僅需5～10min，與CTC、OTC、DC等TCs有很強的交叉反應(yīng)，而與沙丁胺醇、萊克多巴胺等其他獸藥無交叉反應(yīng)。方瑩等也建立了快速檢測TC殘留的GICA方法。將制備的膠體金顆粒與抗TC單克隆抗體結(jié)合形成抗TC單克隆抗體金標(biāo)復(fù)合物標(biāo)記在膠體金結(jié)合墊上。并將TC人工抗原包被在硝酸纖維素膜上作為檢測線，待測樣品中相應(yīng)TCs競爭結(jié)合膠體金標(biāo)記的抗TCs單克隆抗體，以顏色直觀顯示檢測的定性結(jié)果。檢測肉類樣品，靈敏度最低值可達(dá)到10ng/mL，只需3～5min，與其他獸藥無交叉反應(yīng)。Le等建立了一種利用膠體金標(biāo)記單克隆抗體一步側(cè)流免疫層析技術(shù)快速檢測豬組織中DC殘留的方法。為了進(jìn)行測定，引入了一個對其他TCs具有較低交叉反應(yīng)的DC膠體金標(biāo)記單克隆抗體，命名為2.3/3A6。測試帶對DC的靈敏度低達(dá)7ng/mL，IC50為(22±2)ng/mL。該測試可在10min內(nèi)完成，裸眼視覺評估LOD為20ng/mL；在20ng/g、40ng/g和80ng/g三個水平，添加回收率分別為81%～95%(肌肉)、81%～92%(肝臟)，日內(nèi)和日間CV分別為3%～6%和4%～8%。

3)放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)

RIA是一種應(yīng)用放射性同位素的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合而成的體外微量分析方法，原理使放射性標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原(待測物)與不足量的特異性抗體競爭性地結(jié)合，反應(yīng)后分離并測量放射性而求得未標(biāo)記抗原的量。

Meyer等將一種商業(yè)化的適用于血液、尿液、牛奶和組織中TCs分析的RIA方法，改進(jìn)用于水樣中TCs的分析，方法LOD約為1.0ppb，半定量水平為1～20ppb。檢測結(jié)果通過了液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)的確證。

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