喹噁啉類藥物殘留分析技術——提取方法

時間：2023-03-25 00:35:00來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

喹噁啉類藥物殘留分析技術——提取方法

[db:作者] / 2022-12-20 00:00

喹噁啉類殘留分析對象主要包括藥物原形及其代謝產物。此外，動物組織中喹噁啉類藥物經過機體代謝，在動物體內N1和N4位脫氧，也常檢測脫一氧和脫二氧中間代謝產物。中間代謝物進一步代謝為QCA或MQCA，QCA和MQCA在動物體內消除緩慢，分別規定為CBX和OLQ的殘留標示物。各代謝物化學結構式見圖15-1 和圖15-2。這兩種殘留標示物均呈現酸性特征，常利用這一特征進行殘留分析。國內研制的CYX、QCT和MQX等產品，殘留標示物還有待確定。

15.1.4.1 前處理方法

(1)提取方法

喹噁啉類藥物不宜在高溫高壓下進行提取，目前主要采用傳統的液液萃取方法(liquidliquid extraction，LLE)來提取動物源基質中的該類藥物。本類藥物中的CBX、OLQ等原形藥物及其脫一氧和脫：二氧對應的脫氧代謝物不與組織結合，直接提取即可。但在動物體內，CBX殘留標示物為QCA，CYX也代謝為QCA；OLQ殘留標示物為MQCA，MQX、QCT也代謝為MQCA。QCA和MQCA為有機酸，極性較強，在動物體內通過共價鍵與一些氨基酸或蛋白質結合，以結合態存在，需要利用酶水解或化學水解方法使之先被釋放出來再進行提取。

1)直接提取

藥物原形以及中間脫氧代謝物不與組織結合，直接提取即可。

Huang等測定雞血液、肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中CYX及其代謝物BDCYX。血漿用等體積甲醇渦動萃取2 min；其他組織，2g樣品先加入1 mL水，渦動混合1 min后，脂肪樣品用甲醇-乙腈(1+1，v/v)提取，其他樣品用乙酸乙酯提取，第一次4mL，然后依次為2×2mL提取，渦動混合后，超聲提取5min，低溫離心取有機溶劑層，凈化后用高效液相色譜(HPLC)測定。CYX和BDCYX的定量限(LOQ)為0.025mg/kg(血漿和組織)；方法回收率在73%～87%之間，日間相對標準偏差(RSD)小于9.86%。Zhang等提取羊組織中CYX及其代謝物BDCYX。5g肌肉、肝臟、腎臟加入2mL水、10mL乙酸乙酯勻漿，脂肪組織加入10mL乙腈勻漿，重復提取一次，取2次提取上清液蒸干，殘留物用乙腈-正己烷液液分配凈化，乙腈層蒸干用甲醇復溶后HPLC測定。CYX的回收率在65%～79%之間，日間變異系數(CV)為6.7%～11.1%；BDCYX的回收率為70%～92%，日間CV為4.7%～15.9%；方法檢測限(LOD)為15μg/kg，LOQ為25ug/kg。He等用乙腈直接提取血液中的CYX代謝物QCA、BDCYX、1-脫氧喹賽多和4-脫氧喹賽多。HPLC測定的檢測限(CCa)為1.0～4.0μg/L，檢測能力(CCβ)小于10μg/L，回收率為87.4%～93.9%，CV小于10%。

Aerts等采用甲醇-乙腈直接提取豬組織中CBX及其代謝物1-脫氧卡巴氧、4～脫氧卡巴氧和BDCBX。10g勻漿樣品(肌肉、肝臟、腎臟)中加入40mL甲醇-乙腈(1+1，v/v)，振蕩混合15min，2000g離心5min，取上清液進一步凈化。HPLC測定的LOD為0.5～1μg/kg(CBX)、2～3μg/kg(BDCBX)、1～2μg/kg(1-脫氧卡巴氧和4-脫氧卡巴氧)，平均回收率為81%～87%，CV為4%～10%。我國國家標準GB/T20746-2006測定牛、豬肝臟和肌肉中CBX殘留。5g試樣中加入5g中性氧化鋁，25mL乙腈-乙酸乙酯(1+1，v/v)混合5min提取，離心取上清液，進一步凈化，液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)測定，LOD為0.5μg/kg，回收率為79%～90%。

Huang等測定豬、雞組織中QCT及其代謝物BDQCT，5g肌肉/肝臟加2mL水，15mL乙酸乙酯；5g脂肪加15mL甲醇-乙腈(1+1，v/v)，振蕩1min，超聲1min，離心取.上清液蒸干，殘留物用乙腈異辛烷溶解和液液分配，蒸千乙腈層，復溶后進HPLC測定。LOD和LOQ分別為0.025mg/kg；和0.05mg/kg；豬組織中QCT回收率為69%～85%，CV為3.8%～11.2%；BDQCT回收率為71%～81%，CV為6.9%～11.2%。雞組織中QCT回收率為67%～82%，CV為9.2%～11.9%；BDQCT回收率為65%～79%，CV為7.7%～10.3%。

Zhang等測定豬尿中MQX及其4種代謝物：1-脫氧乙酰甲喹、4-脫氧乙酰甲喹、BDMQX和MQCA。5mL樣品中加200μL甲醇和60μL四氯乙烷，超聲波萃取4min，離心后HPLC測定。方法LOD為0.16～0.28μg/L，回收率為72.0%～91.3%，CV小于5.2%。

2) 水解后提取

A. 堿解后提取

用堿解方法斷裂QCA或MQCA與蛋白質等結合酰胺鍵，堿性水解液一般用酸中和后，再用有機溶劑萃取，最常用的是乙酸乙酯。在水解過程中，動物組織中部分蛋白質也被水解產生小分子氨基酸和多肽，需要凈化水解的干擾物。

Huang等測定豬和雞組織中QCT代謝物MQCA，樣品采用3mol/L氫氧化鈉在95～100℃堿水解30～40min，然后用濃鹽酸中和，再用乙酸乙酯振搖2min萃取，取乙酸乙酯提取液進一步凈化后用HPLC測定。LOQ為0.05mg/kg，LOD為0.025mg/kg，回收率為74%～84%，CV為4.5%～10.8%。

Huang等用3mol/L氫氧化鈉溶液在100℃，維持30min，水解雞血液和組織中CYX代謝物QCA，水解液用鹽酸中和，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液中的QCA再反萃取至檸檬酸緩沖液，經過陽離子交換柱凈化后，再用稀鹽酸與三氯甲烷液液分配凈化，HPLC檢測。QCA的LOQ為0.025mg/kg(血漿和內臟組織)和0.02mg/kg(肌肉)；回收率為70%～87%，日間RSD為7.69%～1.43%。Zhang；等測定羊組織中CYX代謝物QCA，5g樣品加入10mL 3mol/L氫氧化鈉溶液，100℃堿解30min，冷卻至室溫，加入4mL濃鹽酸混勻中和，離心，取上清解離液進一步凈化后，采用HPLC測定。QCA的回收率為70%～82%，日間CV為6.6%-11.1%；LOQ為25μg/kg，LOD為15μg/kg。Hutchinson等測定豬肝臟中CBX代謝物QCA，5g組織加入3mol/L氫氧化鈉溶液10mL，在100℃水解樣品30min，解離與組織結合的QCA，水解液用4mL濃鹽酸充分中和，用乙酸乙酯提取，提取液經液液分配和固相萃取凈化后，再用LC-MS/MS測定。方法回收率為89%～109%，CV為0.15%～10%，CCa和CCβ分別為0.16 ug/kg和0.27 μg/kg。

B.酸解后提取

用氫氧化鈉溶液水解血液和組織中QCA和MQCA，需要在90～100℃高溫進行，動物組織中部分蛋白質也會發生分解，產生較多的小分子氨基酸，增加了樣品測定的干擾，影響檢測。酸性條件下水解主要采用稀酸或稀酸有機溶劑混合液來水解，加熱溫度較低，水解產生的游離基質成分較少，酸水解較為徹底，減少MQCA和QCA的降解損失，并有效釋放結合態的MQCA和QCA，效果優于堿性水解。藥物水解后轉移至酸性水解液，提取時將水解液離心，直接取上清液凈化即可，這樣水解和提取同步進行。最常用的酸有鹽酸和偏磷酸。

Zhang等建立了魚、對蝦體內OLQ代謝標志物MQCA的殘留測定方法。5g樣品加入15mL2mol/L鹽酸溶液，渦動混合2min，蓋塞于60℃振蕩酸解1h，然后8000g離心10min，收集酸解上清液，經MAX小柱凈化后，LC-MS/MS測定。LOD和LOQ分別為0.1ng/g和0.25ng/g，在添加0.25～50.0ng/g水平范圍內，平均回收率為92.7%～104.3%，RSD小于6%。呂海鸞等133采用0.2mol/L鹽酸于60℃振蕩1h，水解和提取豬肉、豬肝、豬腎、胖頭魚、對蝦和蟹組織中OLQ的殘留標示物MQCA，提取上清液直接用C18固相萃取柱凈化，LC-MS/MS測定。豬肉、豬肝、豬腎、魚、對蝦和蟹中MQCA的LOD依次為0.90μg/kg、1.51μg/kg、0.94μg/kg、1.04μg/kg、1.62μg/kg和1.80μg/kg，LOQ依次為3.00μg/kg、5.02μg/kg、3.13μg/kg、3.46μg/kg、5.40μg/kg、6.00μg/kg；MQCA的平均回收率均在73.6%～89.0%之間，日內RSD在15%以下，日間RSD為20%以下。梅景良等建立了鯉魚、對蝦中OLQ及其代謝物MQCA的殘留分析方法。取2.5g組織加入7mL 0.3mol/L的HCI溶液，振蕩提取2min，離心轉移上清液，殘渣再用6mL 0.3mol/L的HCI溶液提取一次，C18固相萃取柱凈化，氮氣吹干并用流動相定容后，HPLC測定。當OLQ及MQCA在魚組織中的添加水平分別為20～200μg/kg和35～200μg/kg時，平均回收率分別為83.5%～87.7%和79.6%～87.4%；當OLQ及MQCA在蝦組織中的添加水平分別為15～200μg/kg和30～200μg/kg時，平均回收率相應為74.6%～80.9%和81.0%～86.6%；兩種組織中兩種化合物的批內RSD為0.51%～4.47%，批間RSD為0.66%～7.58%；鯉魚組織中OLQ和MQCA的LOD分別為6ug/kg和10ug/kg，LOQ分別為20μg/kg和35μg/kg；對

蝦組織中OLQ和MQCA的LOD分別為4.5μg/kg和8μg/kg，LOQ分別為15μg/kg和30ug/kg。

Yong等建立了雞組織中QCT代謝物MQCA的測定方法，2g樣品先在氯仿-乙腈(1+2，v/v)超聲波提取2次，每次超聲提取10min，離心后轉移兩次的提取上清液，組織中再加入1mol/L鹽酸，在90s℃水解1h，解離與組織結合的藥物殘留，放置室溫后，加入10mL氯仿-乙腈(1+2，v/v)超聲波提取5min，離心，取有機層蒸干，經進一步凈化后，LC-MS/MS測定。方法回收率為77.1%～95.2%，CV小于15%；CCa為0.24～0.76μg/kg，CCβ小于2.34μg/kg。

采用偏磷酸水解避免了強酸和強堿的使用，水解液直接用有機溶劑萃取，可簡化操作。同時，偏磷酸還可有效沉淀組織蛋白，干擾明顯少于堿水解方法。

Horie等用0.3%偏磷酸甲醇(7+3，v/v)同時解離和提取豬肌肉和肝臟中CBX及其代謝物QCA和BDCBX，渦旋混勻，振蕩提取10min，離心，上清液經HLB固相萃取柱凈化后，LC-MS/MS測定。在添加濃度為2.5ng/g和5ng/g時，QCA和BDCBX的回收率為70.2%～86.3%，LOD均為1ng/g。Xu等測定豬肝中CYX代謝物QCA，用偏磷酸～甲醇-水(2+20+78，v/v)提取，LC-MS/MS測定回收率僅為40%，原因是偏磷酸脫蛋白不徹底，QCA重吸附導致回收率低下；而改用5%偏磷酸-甲醇(8+2，v/v)提取，回收率增加到70%。Della等測定豬肝中QCA，樣品中加入偏磷酸-甲醇-水(2+20+78，v/v)溶液，渦動混合提取1min，離心取上清，凈化后氣相色譜-質譜(GC-MS)測定。方法回收率為90%～102%，CV為1.7%～8.4%，CCa和CCβ分別為32μg/kg和34ug/kg，LOD為0.2μg/kg，LOQ為0.7μg/kg。

Sniegocki等測定豬肌肉中CBX及其代謝物BDCBX、QCA和OLQ及其代謝物MQCA，5g樣品勻漿，加入6mL 2%偏磷酸-20%甲醇-水溶液，混勻后超聲15min提取，然后低溫離心，取上清液進一步凈化，LC-MS/MS測定。方法CCa為1.04～2.11ug/kg，CCβ為1.46～2.89ug/kg，回收率范圍為99.8%～101.2%。Wu等提取動物組織、魚肉中的QCA和MQCA，加入5%偏磷酸-10%甲醇溶液渦動混合提取2min，離心，取上清，再重復提取一次，合并兩次提取液，再進一步凈化，HPLC測定。MQCA和QCA的CC。為0.7～2.6μg/kg，CCβ為1.3～5.6ug/kg，回收率為70%～110%，RSD小于20%。研究發現，提取溶劑中加入適量甲醇可提高藥物的溶解性，但甲醇含量超過10%時，回收率反而低于60%，原因可能是甲醇含量過高影響了蛋白沉淀，降低了偏磷酸的溶解度和影響了組織蛋白對藥物的釋放，從而降低提取回收率。實驗證明5%偏磷酸10%甲醇溶液為最佳。

C.酶解后提取

酶解的方法比酸/堿水解具有更多優點，可以選擇性破壞藥物與組織結合鍵，減少樣品基質共提物，但是耗時較長，一般要在16h以上。酶解前，可用甲酸消化和滅活基體的組織活性酶，提高酶解效率。酶解后的樣品再用酸性溶劑提取，提取的同時也起到脫蛋白的作用。

Hutchinson等測定豬肝中OLQ和CBX的代謝物MQCA和QCA，5g均漿樣品中加入8mL0.2mol/L Tris/HCl緩沖液(pH9.6)和50μL蛋白酶(protease type XIV，50mg/mL)，混勻后于55℃過夜酶解，蛋白酶解液放置室溫后加入1mL濃鹽酸酸化提取，混勻，離心，獲得.上清液，經凈化后，LC-MS/MS測定。QCA的CCa和CCβ分別為0.4μg/kg和1.2μg/kg，MQCA為0.7μg/kg和3.6μg/kg。Merou等測定豬、牛肌肉和豬肝中QCA和MQCA，5g樣品中加入QCA-d4內標，10mL 0.1mol/L Tris緩沖液(pH9.5，含5mg枯草桿菌蛋白酶A)，在52℃孵育2h酶解，酶解上清經固相萃取柱凈化后，LC-MS/MS測定。CBX、MQCA、QCA的CCa和CCβ范圍分別為0.09～0.24μg/kg和0.12～0.41μg/kg，回收率為92%～101%(MQCA、QCA)和60%～62%(CBX)，CV小于12%。林黎等建立了牛奶和奶粉中CBX和OLQ代謝物QCA和MQCA殘留量的LC-MS/MS法。5g牛奶樣品加入10mL 0.6%甲酸溶液，混勻后于47℃振搖1h，然后加入3mL 1.0mol/L Tris溶液和0.3mL蛋白酶水溶液，充分混勻，47℃酶解16～18h，酶解后的樣品溶液加入20mL 0.3mol/LHCI，振蕩混勻后離心15min，上清液過濾，經固相萃取柱凈化后測定。牛奶中QCA和MQCA的LOQ為0.5 μg/kg，奶粉為4.0 μg/kg；平均回收率為68.2%～82.5%，CV為3.4%～ 12%。劉正才等測定動物源食品中OLQ代謝殘留標識物MQCA殘留，5g均質組織樣品加入8mL蛋白復合體消化溶液(0.2 mol/L Tris緩沖鹽溶液含0.1mol/L氯化鈣，HCI溶液調pH9.6)，混勻，再加入0.3mL 10g/L蛋白酶溶液，充分混勻后，47℃搖床酶解16～18h，酶解液經固相萃取凈化后，LC-MS/MS測定。樣品中MQCA的LOQ為0.3～0.5μg/kg，平均回收率在60.7%～107%之間，RSD在4.59%～14.9%之間。

Boison等采用0.6%甲酸于47℃，水浴1 h，消化和滅活豬肌肉和肝臟中活性酶，然后加1 mol/L Tris溶液中和，再加入1 mL蛋白酶于47℃酶解16～18 h，然后加0.3 mol/L鹽酸高速振搖5 min提取，離心取上清液進一步固相萃取凈化，LC-MS/MS 測定。BDCBX和QCA的LOQ分別為0.05 μg/kg和0.5 μg/kg， LOD 分別為0.025 μg/kg和0.3 μgkg，回收率在80%～120%之間。我國國標GB/T 22984-2008測定牛奶和奶粉中CBX和OLQ代謝物殘留量，5g樣品加入10 mL 0.6%甲酸溶液混勻后于：47℃振蕩1h，加入3mL 1 mol/L Tris溶液，再加入0.01 g/mL SIGMA P5147蛋白酶0.3 mL，混勻后于47℃振蕩酶解16～18h。酶解后，采用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH 4)直接均質提取， LC-MS/MS測定。MQCA和QCA的回收率為75%～ 88%，LOD為0.5μg/kg (牛奶)和4μg/kg (奶

粉)。研究發現，溫度和pH對酶的生物活性影響極大，蛋白酶在pH 8.5、47℃時活性最強。酶解之前，先在樣品中加0.6% (體積分數)的甲酸溶液，置于47℃空氣浴中1h，可使牛奶和奶粉中天然存在的其他類型酶失活，然后再用Tris 緩沖溶液調節pH，加入蛋白酶酶解。實驗表明，與用甲酸水解，乙腈-水(1+1， v/v) 提取相比較，該方法效果更好，不僅反應條件溫和，且酶解后藥物與奶制品分離更為徹底。

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