大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類藥物殘留分析技術前處理方法——凈化方法

時間：2023-03-25 05:47:42來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類藥物殘留分析技術前處理方法——凈化方法

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

(2)凈化方法

獸藥殘留分析的凈化步驟非常關鍵，通過凈化起到去除生物樣品中的脂肪、蛋白等干擾物質(zhì)的目的，同時也可以提高檢測靈敏度，延長儀器和色譜柱的壽命。MALs和林可胺類藥物前處理過程中涉及的凈化方法主要有液液分配、固相萃取、基質(zhì)固相分散等。

1)液液分配(liquidliquidpartition，LLP)

LLP是利用待測組分與樣品雜質(zhì)在互不相溶的兩種液體里溶解性不同而得到凈化的一種方法。其優(yōu)點是溶劑易得，而且價格便宜。但也存在一定的缺點，包括乳化現(xiàn)象的形成和待測物在兩相中存在互相的溶解性。氯仿和二氯甲烷常用于從水或堿性溶液中萃取MALs，缺點在于毒性高且易污染環(huán)境。Draisci等利用磷酸鹽緩沖液、水和氯仿進行牛組織中MALs藥物的提取及LLP凈化，經(jīng)渦動離心后液體分為三層：上層為水相，中層為組織相，下層為氯仿相，收集下層進--步固相萃取凈化后，進LC-MS/MS測定。方法回收率在80.4%～90.2%之間，RSD小于14.9%；LOQ在20～150μg/kg之間。

2)固相萃取(solidphaseextraction，SPE)

與LLP相比，SPE不需要使用大量有機溶劑，處理過程中不會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，能簡化樣品的處理過程，但是SPE柱的使用成本較高。盡管如此，SPE仍然是MALs和林可胺類藥物樣品凈化中的主流技術。在MALs和林可胺類藥物殘留分析中，常用的SPE柱主要有基于反相機理的C18柱和HLB柱，以及基于離子交換機理的SCX柱和WCX柱等。從文獻報道的結(jié)果來看，SCX柱和HLB柱對MALs和林可胺類藥物的凈化效果較好。

反相C18 SPE是許多中等或低極性藥物常用的凈化方法。Thompson等應用C18 SPE柱對蜂蜜中的泰樂菌素和林可霉素進行凈化。C18柱用5mL甲醇和5mL水進行活化，蜂蜜首先與10mL的碳酸鹽緩沖液進行混合稀釋后.上柱，用4mL 5%的甲醇-水和4mL 70%的甲醇-水洗滌，再用甲醇和乙腈進行洗脫，濃縮后LC-MS檢測。在0.01μg/g、0.5μg/g、10μg/g三個添加濃度水平，林可霉素和泰樂菌素的平均回收率為84%～107%；LOD為：泰樂菌素0.01ug/g，林可霉素0.007μg/g。陳明等報道了牛奶中克林霉素殘留量的檢測方法。牛奶樣品用20%乙酸溶液和水超聲振蕩提取，離心后，上清液過C18固相萃取柱，用4mL水淋洗，再用6mL甲醇洗脫，經(jīng)氮吹儀吹干后，用流動相溶解定容：至1mL，過0.22um濾膜后，進行HPLC分析。克林霉素濃度在1.0～10.0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系，平均回收率為80.3%～93.9%，CV為1.23%～3.47%，LOD為0.5μg/mL。謝文等建立了蜂王漿中5種MALs殘留量的HPLC方法，并對OasisHLB和C18固相萃取柱的凈化效果進行了比較。首先使用HLB(3mL，60mg)和(6mL，500mg)兩種規(guī)格的小柱，加入50ng混合標準溶液后，用甲醇-水(2+8，v/v)洗滌，雖可去除樣品中色素等雜質(zhì)，但結(jié)果顯示MALs同時也被不同程度地洗脫下來，降低了方法回收率；同樣條件用于C18柱，MALs損失率較小。因此該方法選用C18固相萃取柱進行凈化。5種MALs在0.002～0.05mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關系，加標回收率和相對標準偏差較好。

HLB吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物。它以反相保留機理為主，并通過一個特殊的極性捕獲基團來增加對極性物質(zhì)的保留以提供較好的水浸潤性。Adams等在蜂蜜樣品中加入磷酸緩沖液，置于45℃水浴中10min，再渦旋以使蜂蜜均勻散開，用OasisHLB柱進行凈化。SPE柱用甲醇和提取液活化，上樣后用40%的甲醇洗滌，0.5%氨化乙腈洗脫，氮氣吹干后復溶于50%的甲醇-水中檢測，建立了蜂蜜中林可胺類藥物的測定方法。劉正才等用OasisHLB固相萃取小柱對烤鰻中13種林可胺類和MALs進行凈化。SPE柱先用甲醇和水活化，樣品液流干后用5%甲醇洗滌，再用甲醇洗脫，吹干、復溶并過濾后，LC-MS/MS測定。研究者比較了HLB與C18萃取柱的凈化和富集效果，發(fā)現(xiàn)前者相對較好，在0～100ug/L范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度有良好的線性關系，相關系數(shù)大于0.99，在1.0μg/kg、2.0μg/kg、4.0μg/kg三個濃度水平進行添加回收實驗，平均回收率為70.26%～124.22%，RSD為1.31%～16.00%。

由于MALs呈弱堿性，還可以采用基于陽離子交換機理的SPE柱凈化。張敬平等用甲醇提取雞肝中6種MALs，然后用BondElutSCX固相萃取柱凈化，LC-MS檢測。該方法的LOD為1～10μg/L，在0.05～0.7μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)大于0.996；在0.5μg/g、0.1μg/g兩個添加水平下，回收率范圍為78.5%～93.4%，RSD小于7.2%。該研究比較了三種不同保留機理的SPE柱對MALs的富集效果:反相保留機理的BondElut C18柱(100mg，1mL)和OasisHLB柱(200mg，3mL)，離子交換保留機理的BondElutSCX柱(500mg，3mL)，以及混合保留機理的BondElutPlexa柱(200mg，3mL)。結(jié)果表明SCX柱和HLB柱的保留效果較好，最終從凈化效果考慮，選擇SCX柱作為樣品凈化柱。

3) 基質(zhì)固相分散萃取(matrixsolid-phasedispersion，MSPD)

MSPD的原理是將涂漬有C18等多種聚合物的擔體固相萃取材料與樣品一起研磨，得到半干狀態(tài)的混合物并將其作為填料裝柱，然后用不同的溶劑淋洗柱子，將各種待測物洗脫下來。其優(yōu)點是濃縮了傳統(tǒng)樣品前處理中的樣品勻化、組織細胞裂解、提取、凈化等過程，不需要進行組織勻漿、沉淀、離心、pH調(diào)節(jié)和樣品轉(zhuǎn)移等操作步驟，避免了樣品的損失，使分析者能同時制備、萃取和凈化樣品。Bogialli等的研究表明，對于MALs來說，熱水可作為一種較好的萃取劑而避免了有機溶劑的使用，且不會影響方法的準確度。將牛奶分散于硅藻土中，最終目標分析物將在70℃加熱的狀態(tài)下通過30mmol/L的甲酸作用下經(jīng)過MSPD柱洗脫下來，洗脫液經(jīng)過pH值調(diào)節(jié)和過濾，可直接用HPLC分析測定，牛奶中MALs的回收率可達到68%～86%。Frenich等利用MSPD進行了雞蛋中MALs的提取與凈化處理，首先將0.5g雞蛋與2g的C18擔體材料進行玻璃杵均勻混合，直到均一黃色物質(zhì)出現(xiàn)為止，然后裝柱(含2g硅酸鎂載體，并事先過夜加熱至130℃活化處理)，經(jīng)甲醇、乙腈、35%氨水-甲醇(0.04%，v/v)進行洗脫，最后氮吹濃縮后復溶后UPLC-MS/MS分析。方法回收率在60%～119%之間，RSD小于25%；LOQ小于等于5μg/kg。

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