大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類藥物殘留測定方法——微生物法和氣相色譜法

時間：2023-03-25 05:45:48來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類藥物殘留測定方法——微生物法和氣相色譜法

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

6.1.4.2 測定方法

MALs種類較多，結(jié)構(gòu)相似，對于該類藥物的安全使用和殘留檢測一直是各國關(guān)注的焦點和研究的重點。而林可胺類藥物常常與MALs同時使用，因此需要進(jìn)行多殘留同時分析。目前，國內(nèi)外關(guān)于MALs和林可胺類藥物殘留分析的文獻(xiàn)較多，其檢測方法主要包括微生物法、免疫分析法(IA)、薄層色譜法(TLC)、毛細(xì)管電泳法(CE)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)和液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等?？傮w說來，大多儀器分析技術(shù)基本都可用于兩類藥物的殘留檢測，以HPLC和LC-MS最為常見。隨著殘留分析技術(shù)的發(fā)展，CE和TLC由于靈敏度達(dá)不到要求而逐漸被色質(zhì)聯(lián)用法所代替。

(1)微生物法(microbiologicalanalysis)

微生物法是經(jīng)典的MALs含量測定方法。王敏等利用微生物生長抑制的原理，對6種MALs殘留進(jìn)行了定性檢測。該方法通過MALs敏感菌Bacillusstearothermophilus細(xì)菌的生長與否，來判斷MALs的存在。該方法對多種基質(zhì)的動物源食品檢測限低，能夠達(dá)到食品中MALs的MRL的1/2，操作簡單且不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，可作為有效的篩選方法。Nouws等建立了微生物法測定牛奶中MALs等多種類藥物的殘留量。該方法以枯草桿菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌等作為試驗用菌株，通過平板上抑制區(qū)域的大小來判斷藥物殘留量的多少，除了少數(shù)幾種藥物，大多數(shù)待測抗生素的靈敏度都能滿足歐盟所規(guī)定的牛奶中抗生素MRLs的要求，待測的48種抗生素均未超過歐盟所規(guī)定的MPLs。在規(guī)定MRLs水平上，7種培養(yǎng)板的平均CV為4.5%～9.8%。黃曉蓉等利用微生物抑制法檢測了肉類、水產(chǎn)品及蛋中的MALs殘留量，方法的LOD值為0.05mg/kg。采用藤黃微球菌ATCC9341、枯草芽胞桿菌ATCC663、蠟樣芽孢桿菌蕈狀變種ATCCI1778為敏感菌，一次操作可同時檢測肉類、水產(chǎn)品及蛋中的四大類抗生素殘留。微生物法作為篩選方法具有簡便、快速、易操作等優(yōu)點，但由于固有的局限性，結(jié)果可比性差，方法靈敏度不佳，達(dá)不到準(zhǔn)確定性定量分析的目的，逐漸被儀器分析方法所取代。

(2)薄層色譜法(thinlayerchromatography，TLC)

TLC法用薄層板將樣品提取液中被測物展開分離后，測定樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品吸收光變化或采用發(fā)射光薄層掃描法來測定被測物含量。Ramirez等引采用了高效薄層色譜(HPTLC)-生物自顯影方法進(jìn)行牛奶中紅霉素等藥物的多殘留檢測。該方法采用枯草桿菌作為檢測目標(biāo)微生物，殘留的抗生素用乙腈進(jìn)行提取，石油醚進(jìn)行除脂后，用二氯甲烷進(jìn)行分離。該方法完全滿足牛奶中殘留限量的要求，平均回收率達(dá)90%～100%，CV為7.2%～21.3%。這種高效薄層色譜分析大大地縮短了分析時間，并有效地改善了紅霉素等藥物的敏感性。韓南銀等建立TLC法來檢查蜂蜜中殘留的紅霉素。以固相萃取對紅霉素進(jìn)行了提取，極性的硅膠作固定相，乙酸乙酯～乙醇-15%醋酸銨混合液(86+38+76，v/v)為展開劑，濃硫酸-香草醛-95%乙醇混合(4+0.33+36，v/v)作為顯色劑，其LOD可達(dá)5mg/kg。

(3)毛細(xì)管電泳法(capillaryelectrophoresis，CE)

作為分離技術(shù)中的一種，CE有較高的分離效率，可同時分析多種待測成分，且所需時間較少，并能準(zhǔn)確定量。但是，也存在一些缺點，比如對于上樣量較少的樣品來說，往往靈敏度不夠。此種方法用于MALs和林可胺類藥物殘留分析的報道較少。李向麗等基于泰樂菌素能增強(qiáng)聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)32+]電化學(xué)發(fā)光信號的現(xiàn)象，結(jié)合CE分離技術(shù)，建立了動物組織和蜂蜜中泰樂菌素測定的新方法。實驗分別對檢測和分離條件進(jìn)行了優(yōu)化，在優(yōu)化條件下，泰樂菌素在濃度0.05～10.00μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，LOD為0.02ug/mL，用于實際樣品中泰樂菌素的測定，回收率為80.0%～95.0%。

(4)氣相色譜法(gaschromatography，GC)

MALs和林可胺類藥物的分子量均較大，而且結(jié)構(gòu)中含有較多的極性基團(tuán)，直接采用GC分析是不行的，必須經(jīng)過衍生化后才可以進(jìn)行GC分析。

Luo等建立了鮭魚組織中林可霉素的GC檢測方法。采取磷酸緩沖液提取鮭魚組織中的林可霉素，經(jīng)C18固相萃取凈化后，用N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺作衍生化試劑進(jìn)行衍生，形成一個三甲基硅烷基，再進(jìn)行GC分析，氮磷檢測器(nitrogen-phosphorusdetector，NPD)檢測。該方法在25～250ng/g濃度范圍內(nèi)線性較好，相關(guān)系數(shù)r為0.994；在50ng/g、100ng/g、200ng/g三個添加濃度水平上，平均回收率均大于80%，RSD均小于6%；LOD為1.7ppb，LOQ為3.8ppb。陶燕飛等建立了動物可食性組織中林可霉素和大觀霉素殘留量的GC測定方法。提取物中加入500μL硅烷化試劑(BSTFA)和100μL乙腈，渦旋混合1min，密封，75℃恒溫箱中衍生化反應(yīng)1h后，GC分離后NPD測定。該衍生化產(chǎn)物較為穩(wěn)定，密封情況下至少一周不會降解，但應(yīng)避免置于潮濕環(huán)境中。林可霉素的LOQ為30μg/kg，在30～3000ug/kg添加水平，回收率為73.2%～85.7%。該作者還應(yīng)用GC-NPD和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)建立了一種定性、定量測定動物性食品中林可霉素和大觀霉素殘留的多維分析方法。該方法采用磷酸鹽緩沖進(jìn)行液加速溶劑萃取(ASE)，三氣乙酸脫蛋白，加入十二烷磺酸鈉作為離子對試劑進(jìn)行C18固相萃取凈化，洗脫液吹干后用BSTFA衍生化，進(jìn)行GC-NPD分析和GC-MS確認(rèn)。這兩種藥物在GC-NPD方法中的LOQ分別為16.4μg/kg和21.4μg/kg，在GC-MS方法中的LOQ分別為4.1μg/kg和5.6μg/kg；添加水平為20～200μg/kg時，GC-NPD方法的回收率為73%～99%，RSD小于17%；添加水平為5～20μg/kg時，GC-MS方法的回收率為70%～93%，RSD小于21%。Takasuki等建立了組織中ERM、OLE、SPI、KIT、TYL的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析方法。肉樣經(jīng)甲醇提取、LLP后，再使用硅膠固相萃取柱凈化以除去干擾物質(zhì)。提取物在鉑的催化下加氫，打開碳碳雙鍵結(jié)構(gòu)，并在0.3mol/L鹽酸中水解脫去中性糖鏈，水解產(chǎn)物在醋酸酐-吡啶中酰化生成醋酸酯。衍生化的目的在于降低待測物的分子量和極性，而使用醋酸酐?；^硅烷化得到的衍生物分子量更小，可提高質(zhì)譜檢測的靈敏度。

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