甾類同化激素類藥物殘留分析技術——前處理方法（三）

時間：2023-03-25 05:24:45來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

甾類同化激素類藥物殘留分析技術——前處理方法（三）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

3)免疫親和色譜(immunoffinity chromatography，IAC)

IAC的原理是將抗體固定在固相載體材料上，制成免疫親和吸附劑，將樣品溶液通過吸附劑，樣品中的目標化合物因與抗體發生免疫親和作用而被保留在固相吸附劑上。然后用緩沖液或有機溶劑作為洗脫劑，使目標化合物與抗體解離，從而使目標化合物被萃取和純化。與傳統的SPE相比，利用抗原-抗體結合機制進行凈化的IAC柱具有更好的選擇性，凈化效果好，可重復多次使用，但是一般只能用于單組分或特定種類化合物殘留的凈化。

徐燕等將去氫甲睪酮多克隆抗體同CNBr-Sepharose 4B 進行偶聯，制成了對去氫甲睪酮具有特異性免疫性吸附的IAC柱，并優化了制備和使用條件；同時，用間接競爭酶聯免疫(ELISA)和HPLC法對該IAC柱的性能進行了評價。CNBr-Sepharose4B偶聯抗體的最佳反應時間為2.5h，抗體最佳初始質量濃度為0.5mg/mL，IAC的柱容量約為1700ngDMT/g干膠，最佳洗脫溶液為80%甲醇溶液。該柱平均加標回收率為97.87%，重復使用三次后，回收率仍不低于90%。Gasparini等建立了一種同時檢測牛尿中諾龍、群勃龍殘留的LC-MS/MS確證分析方法。牛尿用β-葡糖苷酸酶過夜酶解，冷卻至室溫后，離心收集上清液，過IAC柱凈化。IAC柱用淋洗液活化后上樣，淋洗液和水淋洗，甲醇-水(70+30，v/v)洗脫，氮氣吹干，甲醇-水(50+50，v/v)復溶上樣。方法CCa為0.54～0.60μg/L，回收率大于64%，批間RSD為1.6%～5.7%，批內RSD為1.6%～6.0%。

4)凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography，GPC)

GPC是根據分析物的相對分子質量或者體積進行分離，相對分子質量大的先流出，相對分子質量小的后流出，適用于脂肪等大分子物質中小分子藥物的凈化。Kaklamanos等采用GPC凈化了腎脂肪中促孕激素(醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸美侖孕酮)。樣品經正已烷稀釋后，加入二氯甲烷，再用GPC凈化。GPC采用1000mm×25mm內徑玻璃色譜柱，填充生物珠(S-X3，200～400目)進行凈化，流速為5mL/min，最大耐受壓力150psi，紫外檢測波長設定為254nm。收集35～44min流出液，40℃水浴旋轉蒸干，復溶后，反相LC-MS/MS分析。該方法的CCa為0.20～0.22ng/g，CCβ為0.33～0.38ng/g，回收率為72.0%～89.2%。

5)基質固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是一-種快速、簡單、廉價、高效耐用的樣品處理技術，其基本操作是把樣品直接與適量的反相鍵合硅膠-起混合研磨，使樣品被均勻分散于固定相顆粒表面制成半固態，裝入層析柱中，然后采用類似SPE的操作進行洗滌和洗脫。MSPD避免了樣品勻化、轉溶、乳化、濃縮造成的待測物損失。MSPD技術使用樣品量少，要求檢測方法具有較高的靈敏度。Dong等開發了基于MSPD原理的凈化技術，凈化水產品中的雌激素。采用乙腈提取魚肉和蝦肉中4種雌激素(17β-雌二醇、雌三醇、4-羥雌二醇和2-甲氧基雌二醇)，渦動混勻，再加入硫酸鎂和氯化鈉，混勻后，冷凍離心。將上清液轉移，加入50mg乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和100mg無水硫酸鎂，渦動混勻后離心。上清液過膜后，直接采用HPLC-熒光檢測器(FLD)分析。4-羥雌二醇平均回收率為60%，其他3種藥物平均回收率高于80%，日內RSD小于12%。

6)渦流色譜萃取(turbulent flow chromatography，TFC)

渦流色譜技術是利用大粒徑填料使流動相在高流速下產生渦流狀態，從而對生物樣品進行凈化與富集。現已經發展成為一種直接進樣、快速凈化和分離生物樣品的前處理技術。Moeller等開發和驗證了一種定量檢測馬血清中35種ASs的方法，可同步檢測血清中的雄激素、雌激素、孕激素及其代謝產物。該方法采用二維液相系統(2D-LC)，在線TFC提取，帶有電噴霧離子源(ESI)的LC-MS/MS測定，通過SRM或選擇離子監測(SIM)對分析物進行鑒定和定量。2D-LC-TFC-MS/MS具體參數:一維分離時采用Thermo Cyclone P提取柱(50mm×0.5mm，60μm)進行稀釋血清樣品提取，二維分離采用ACE C18分析柱(100mm×2.1mm，3μm)進行反相梯度洗脫，柱溫為30℃；流動相分別為0.2%甲酸溶液、甲醇、乙腈異丙醇-丙酮(60+30+10，v/v)和含0.1%氨水的水-乙腈(98+2，v/v)；四元泵用于在線樣品提取，二元泵用于反相梯度分離。進樣后，血清中分析物經TFC提取，然后轉移至二維色譜分離，采用MS/MS檢測。該研究對分析物的回收率及基質效應進行了評價，大多數分析物的日間及日內CV均低于20%，準確度差異在20%以內；其LOD及LOQ分別為0.025～10ng/mL和0.125～25ng/mL。該方法已應用于英國良種馬內源性甾醇類物質的監測。

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