硝基呋喃類代謝物最大允許殘留限量和分析技術——前處理方法（二）

時間：2023-03-25 05:08:49來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

硝基呋喃類代謝物最大允許殘留限量和分析技術——前處理方法（二）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

(3)提取和凈化

NFs代謝物檢測過程中常用的樣品提取、凈化方法包括液液分配法(LLP)、固相萃取法(SPE)和沉淀法等，近年來超臨界流體萃取(SFE)、基質固相分散技術(MSPD)等也有應用。

1)沉淀法(precipitation)

對于奶粉、蛋粉等高蛋白、高脂肪樣品，在水解、衍生化蛋白結合態硝基呋喃代謝物后，可加入蛋白質沉淀劑ZnSO4和K4Fe(CN)6，有效去除奶粉、蛋粉中的蛋白，避免提取、凈化過程中的乳化、膠化現象。彭濤等22用LC-MS/MS法同時測定奶粉中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代謝物。鹽酸水解奶粉中蛋白結合的代謝物，同時加入2-硝基苯甲醛，37℃過夜衍生化。加入ZnSO4，調至pH7.0后，再加入K4Fe(CN)6去除蛋白。然后用乙酸乙酯提取，正己烷凈化，分析物采用電噴霧電離(ESI)正離子、多反應監測(MRM)模式檢測，內標法定量。在添加濃度0.5～2μg/kg范圍內，內標法回收率為89.5%～110.3%；相對標準偏差(RSD)小于11.3%；AMOZ、AOZ方法LOD為0.05ug/kg，SEM、AHD為0.1μg/kg。

對于蜂王漿樣品，三氯乙酸是一種很好的蛋白沉淀劑，同時其較強的酸性又可以提供合適的酸性反應環境。丁濤等報道了LC-MSMS測定蜂王漿中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮4種NFs代謝物殘留的方法。以三氯乙酸作為蜂王漿的蛋白質沉淀劑，同時提供衍生化反應所需的酸性環境。實驗發現pH7～7.5時，AHD、AOZ、SEM和AMOZ代謝物的衍生產物提取效率最高，分別為92.1%、95.1%、91.4%和94.3%。在不同的pH條件下，4種代謝物的衍生產物的萃取效率影響不一樣。對于AHD而言，當pH8～10時，萃取效率極低；對于AMOZ而言，當pH3～5時，完全不能將其從水相中提取至有機相中。AOZ和SEM對pH的敏感程度不是很高，但是在弱堿性條件下(pH7～7.5)，提取效率最高。因此，在進行提取步驟的時候，需要進行比較準確的pH調節，才可以最大限度地提取4種代謝物的衍生產物。

2) 液液分配(liquidliquidpartition，LLP)

NFs代謝物的LLP，一般是在pH7的水溶液中與乙酸乙酯進行兩相分配。但這種方法有時出現乙酸乙酯和水相分層不徹底的情況，易產生干擾，從而影響回收率。特別是對高蛋白、高脂肪、高淀粉的樣品，可加入少量的十二烷基磺酸鈉以緩解乳化現象。為達到更好的凈化效果，也常采用正己烷對提取液做進一步凈化。

Lopez等應用10%氯化鈉溶液來溶解蜂蜜，離心之后取上清液過OasisHLB固相萃取柱，用洗脫液進行水解和衍生化反應。調節pH7.15～7.25之后，用正己烷LLP除脂，然后再用乙酸乙酯LLP。有機相濃縮后用甲醇和水復溶，過0.2um的PTFE濾膜完成樣品的前處理。Rodziewicz建立了牛奶中NFs代謝物的LC-MS方法。牛奶樣品經離心(3500r/min，10min，4℃)去除上層脂質層后進行水解衍生化，冷卻至室溫后，加入磷酸鈉和NaOH調節pH，再用乙酸乙酯進行LLP，收集有機相蒸干并復溶于流動相中，過濾膜后上LC-MS/MS檢測。

同時，樣品溶液的pH對萃取效率有很大的影響。丁濤等試驗了不同pH對回收率的影響，發現pH在7.0～7.5時，AHD、AOZ、SEM、AMOZ衍生化產物的提取效率最高，分別為92.1%、95.1%、91.4%、94.3%。

3) 固相萃取法(solidphaseextraction，SPE)

SPE廣泛應用于動物組織樣品中NFs代謝物的凈化。主要有基于反相保留原理的C18、HLB、EN、CN柱，基于離子交換原理的MAX柱等，多種原理的串聯柱、復合用柱也被大量采用，顯著提高了凈化效果。

彭濤等對普通C18SPE柱和以乙烯吡咯烷酮-_二乙烯基苯共聚物為吸附劑的OasisHLBSPE柱進行比較，發現后者對分析物有很強的選擇性保留，而大多數基質干擾物則保留較弱。共聚物吸附劑可能通過π-π作用而使硝基芳烴衍生物保留。Hormazabal等應用85%三氯乙酸來提取豬肉中的NFs代謝物，正己烷LLP除脂，然后進行衍生化反應，選擇OasisHLB柱進行凈化，乙腈-水(70+30，v/v)作為洗脫液進行洗脫，而后加入--定體積的三氯甲烷從洗脫液中萃取出目標化合物，經離心去除水相，轉移有機相后蒸干，復溶于水中，過濾膜后用LC-MS檢測。龐國芳等應用LiChrolutEN柱對禽肉中經過水解和衍生化的NFs代謝物進行凈化，采取pH7.4的緩沖液淋洗SPE柱，再用乙酸乙酯進行洗脫，氮氣吹干后用流動相進行復溶，最后用儀器測定。該方法重點研究了不同處理步驟對結果的影響。研究發現，當衍生化后反應溶液調pH并用乙酸乙酯提取兩次，這種方法有時會出現乳化現象，乙酸乙酯和水相分層不徹底，易產生干擾，從而影響回收率。另一方面則是比較4種不同的SPE柱的凈化效果和回收率：OasisMAX(60mg，3mL，Waters)、OasisHLB(60mg，3mL，Waters)、C18(500mg，3mL，J.T.Baker)、LiChrolutEN(200mg，3mL，Merck)。結果發現，LiChrolutEN柱的凈化效果和回收率優于另外三種SPE柱。林黎明等比較了MAX、HLB復合柱法、ENSPE單柱法、HLB單柱法和乙酸乙酯LLP方法，比較了甲醇-乙酸洗脫液和乙酸乙酯洗脫液的效果，最終確定主要采用的提取和凈化步驟是：對于肉類組織采用ENSPE柱凈化，乙酸乙酯洗脫；對于肝、蝦等易產生高度混濁濾液的樣品則先采用乙酸乙酯提取，再用ENSPE柱凈化。實驗表明，MAX、HLB復合柱法操作較繁，并要求嚴格控制洗脫液的pH；而單純采用LLP法，對某些復雜樣品凈化效果不佳。實驗研究了在樣品處理過程中添加適量硅藻土，與樣品同時研磨，改變其黏稠性，再進行水解，可明顯提高凈化效果，回收率可達70%～95%，實驗表明HLB柱與EN柱有同樣的效果。

王媛等提取水產品中的NFs代謝物，為了去除提取物中的水溶性雜質，采取LLP的方法，將被測物萃取到有機相中，進行初步凈化。將衍生化之后的上清液調至pH7.0左右，然后用30mL乙酸乙酯分兩次萃取，可以達到良好的效果。進一步的凈化采用C18-CN混合柱，洗脫SPE柱時，比較了2mL甲醇和5mL乙酸乙酯對4種組分的洗脫效果。用5mL乙酸乙酯洗脫時，AMOZ的回收率偏低，僅為50%，其他3個組分可以滿足殘留檢測要求，回收率在90%～110%；采用2mL甲醇洗脫，各組分的回收率都高于80%，但甲醇用量過大也會使雜質與目標化合物一起被洗脫出來。Conneely等建立了動物肝臟組織中NFs代謝物的LC-MS/MS方法。絞碎勻漿的肝臟組織經甲醇和水洗滌，然后再依次經預冷的甲醇、乙醇和乙醚洗滌，離心后保留下層固相樣品，加入鹽酸溶液和酶進行水解和衍生化反應，經乙酸乙酯提取三次后用氮氣吹干，復溶于Tris緩沖液中(pH6.3)，然后用兩種串聯的SPE柱純化。先用OasisMAX柱凈化，以甲醇、水和Tris緩沖液(pH6.3)進行活化，隨后用2%氨水淋洗，甲醇進行洗脫。洗脫液用氮吹濃縮后復溶于水中。第二級凈化柱為OasisHLB，用甲醇和水進行活化，50%的甲醇溶液(含2%的乙酸)進行洗滌，之后應用90%的甲醇溶液(含2%的氨水)洗脫衍生化代謝物。洗脫液氮氣吹干后復溶于水-乙腈(2+1，v/v)溶液中，過濾膜后LC-MS/MS分析。肝臟樣品的分析相對更為困難，容易產生干擾和嚴重的離子抑制現象，串接的SPE方法純化樣品并保證了回收率，是處理復雜基質樣品的有效手段。

4)超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，SFE)

SFE具有高效快速、節約溶劑等優點，但是需要在專門的儀器中才能實現。Arancibia等利用SFE技術來提取、凈化尿液中的呋喃妥因及其代謝物。使用SFE-400超臨界萃取裝置，10mL的不銹鋼管作為提取柱，熔融的石英管作為限流裝置，乙腈作為修飾劑，乙腈-CO2混合提取液的流動速度為0.5mL/min，壓力為2500psi，爐溫和限流器的溫度為80℃，萃取時間為20min。萃取液采用高效液相色譜-紫外檢測器(HPLC-UVD)在310nm測定。呋喃妥因的線性范圍為10.9～378.0umol/L(R=0.9995)，其代謝物為3.0×103～21.0umol/L(R=0.9992)；檢測限分別為12.1umol/L和0.9umol/L。

5)加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction，ASE)

安強等建立了利用ASE-HPLC快速測定動物源食品中NFs代謝產物的方法。稱取已搗碎的樣品10.0g，與20g硅藻土混合均勻，填入33mL的萃取池中，萃取池放入ASE儀的加熱爐腔內，在設定的萃取條件下完成萃取過程。作者優化了萃取溶劑、萃取溫度、萃取壓力、萃取時間等條件。最佳萃取溶劑為體積比1：1的甲醇-三氯乙酸(0.68mol/L)，最佳萃取溫度100℃，最佳萃取壓力1.0×107Pa，最佳萃取時間10min×3次。萃取液冷卻過濾后，用鄰氯苯甲醛衍生化，NaOH調至pH7.0，乙酸乙酯LLP，再過C18-CN混合SPE柱凈化，用HPLC-UVD檢測。方法LOD(S/N=3)為：SEM 0.005μg/mL，AHD 0.005μg/mL，AMOZ 0.005μg/mL，AOZ 0.005μg/mL；添加濃度5.0mg/kg時的回收率分別為：SEM88.6%±3.8%，AHD82.9%±4.9%，AMOZ89.3%±3.9%，AOZ93.7%±3.8%。Tao等利用ASE和超聲波加速衍生技術建立了鯉魚和黃鱔中4種NFs代謝物的測定方法。采用ASE提取分析物，超聲波中衍生反應1h，再用SPE進行凈化。方法的CCa在0.07～0.13μg/kg之間，CCβ在0.31～0.49μg/kg之間，方法回收率為77.2%～97.4%。與傳統方法相比，該方法大大縮短了前處理時間。

6)固相支撐液液萃取(solid-supported-liquid-liquidextraction，SSLLE)

祝偉霞等采用硅藻土SSLLE和平行蒸發聯用前處理技術進行凈化和富集，建立了雞肉、蜂蜜、牛奶中呋喃唑酮代謝物(AOZ)、呋喃它酮代謝物(AMOZ)、呋喃妥因代謝物(AHD)和呋喃西林代謝物(SEM)的超高效液相色譜-串聯質譜(UHPLC-MS/MS)確證方法。NFs代謝物經衍生化后，采用超高效1.7μm C18柱分離4種待測物，同位素內標法定量。AOZ和AMOZ的最低檢測限為0.1μg/kg，AHD和SEM為0.25μg/kg；3個不同添加水平時該方法回收率為85.6%～104.3%，RSD為3.2%～9.5%。樣液在柱中的平衡時間是影響回收率的重要參數，該研究分別測定不同平衡時間對萃取效率的影響，結果表明30min時溶液能與硅藻土填料形成牢固的支撐作用。同時優化了不同體積乙酸乙酯的萃取效率，20mL乙酸乙酯回收率為85%，40mL乙酸乙酯在重力作用下能完全萃取固相萃取柱中4種NFs代謝物。

7)基質固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion，MSPD)

曹文卿等采用MSPD技術，經LLP凈化，同位素內標定量，建立了蛋黃粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮等NFs代謝物殘留的LC-MS/MS測定方法。利用硅藻土為基質分散劑對蛋黃粉進行基質分散，三氯乙酸溶液沉淀蛋白并提供水解環境，2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯LLP等前處理手段對蛋黃粉中的NFs代謝產物進行了提取和凈化。該方法LOQ為0.5μg/kg，線性范圍為0.5～6.0μg/kg，室內驗證回收率范圍為90.06%～109.8%，RSD為2.0%～7.7%。該方法適用于殘留檢測實驗室對蛋黃粉類基質中NFs代謝產物的監控檢測。

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