糖皮質激素類藥殘留分析技術——前處理方法（一）

時間：2023-03-25 02:34:54來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

糖皮質激素類藥殘留分析技術——前處理方法（一）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

10.1.4 殘留分析技術

10.1.4.1 前處理方法

(1)水解方法

由于GCs會與內源性的葡萄糖醛酸結合，以結合態形式存在于生物基質中，在分析GCs殘留時，常需要使用酶水解樣品，釋放出游離態的GCs。使用最多的是β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶等。

Yang等叫利用酶水解提取肌肉(豬肉、牛肉和蝦)、牛奶和肝臟中的50種同化激素(包括曲安西龍、潑尼松、可的松、氫化可的松、潑尼松龍、氟米松、醋酸氟氫可的松、甲潑尼龍、倍氯米松、地塞米松、曲安奈德、氟輕松、布地奈德、丙酸氯倍他索等GCs)。在5g樣品中加入10mL乙酸鹽緩沖液(0.2mol/L，pH5.2)，再加入100μL葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶，37℃過夜，甲醇提取，固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)檢測。方法的定量限(LOQ)為0.04～2.0μg/kg，平均回收率為76.9%～121.3%，變異系數(CV)為2.4%～21.2%。李存等口在豬肝臟樣品中加入50μL的β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，在10mL乙酸銨溶液中，40C下酶解2h。在0.75μg/kg、1.5μg/kg和2.0μg/kg添加水平下，樣品中地塞米松和倍他米松的回收率在97.3%～111%之間。韓立等利用酶水解提取動物尿液樣品中潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、醋酸氟氫可的松、醋酸可的松和氫化可的松等9種GCs，準確吸取尿液試樣5.0mL，置于50mL離心管內，用乙酸調pH5.2，加入0.02mol/L乙酸銨緩沖液5.0mL，再加入β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶50μL，渦旋混勻，于37℃±1℃避光振蕩16h。乙酸乙酯提取，HLB柱串聯氨基柱凈化，LC-MS/MS分析。方法的檢出限(LOD)為0.5ng/mL，LOQ為1.0ng/mL，回收率為55.0%～106.2%，批內、批間CV均低于15.4%。

VanDenHauwe等使用蝸牛液(Helixpomatiajuice)水解牛肝臟樣品，建立了可以檢測11種GCs(倍他米松、地塞米松、氟米松、潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、氟氫可的松、曲安西龍、曲安奈德、倍氯米松和可的松)的LC-MS/MS方法，并對酶水解的溫度、pH和水解時間進行了優化。結果顯示，在pH5.2、40℃、時間不超過4h時，可以取得滿意的水解效果。

(2) 提取方法

GCs殘留分析主要采用液液萃取(LLE)的提取方法。近年來，一些新的提取技術，如加壓溶劑萃取(PLE)、超聲輔助萃取(UAE)、固相微萃取(SPME)等也開始應用到GCs殘留的提取中。

1) 液液萃取(liquidliquidextraction，LLE)

LLE是最為常用的GCs提取方法，提取溶劑主要包括甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚、乙醚、乙酸乙酯以及緩沖溶液等。

牛晉陽等建立了豬肉中GCs多殘留分析方法。樣品經甲醇提取，免疫親和柱凈化后，采用LC-MS/MS進行檢測分析。GCs的線性范圍均為0.5～100μg/kg，低、中、高3種質量濃度加標回收率均為78%～101%，LOD為0.2～2μg/kg。崔曉亮等開發了牛奶中12種GCs殘留的分析方法。試樣中加入pH5.20的醋酸鹽緩沖溶液和甲醇，超聲提取，去除部分蛋白質，然后用正已烷脫脂，依次經HLB柱、硅膠柱和氨基柱等固相萃取柱濃縮和凈化后，LC-MS/MS測定。該法的LOD為0.02～0.38μg/kg，LOQ為0.07～1.27μg/kg；添加水平為2ug/kg和0.4ug/kg時，加標回收率為69.3%～94.3%，相對標準偏差(RSD)為3.5%～16.7%。VandenHauwe等報道了檢測牛腎臟、肌肉和毛發中GCs的方法。樣品經酶水解后，用甲醇提取，固相萃取柱凈化后用LC-MS/MS測定。方法性能指標滿足殘留分析要求。徐錦忠等建立了雞肉和雞蛋中潑尼松、潑尼松龍、地塞米松、氟氫可的松、甲基潑尼松、倍氯米松及氫化可的松多殘留檢測方法。樣品經乙腈超聲提取，正已烷脫脂凈化后，進行LC-MS/MS定性及定量分析。該方法的LOQ為0.5μg/kg；在0.5μg/kg、1.0μg/kg和5.0μg/kg濃度添加水平，平均回收率為73.4%～108.9%，RSD為3.4%～13.4%。Zhang等建立了檢測血漿中地塞米松和地塞米松磷酸鈉的分析方法。采用乙腈-甲醇混合溶液提取并沉淀蛋白，LC-MS/MS測定。該方法在0.5～500ug/L呈線性(r大于0.99)，日內和日間的CV小于10%，LOQ為0.5ug/L。

李飛等建立了速凍調制肉制品中7種GCs(潑尼松、潑尼松龍、地塞米松、倍他米松、氟氫可的松乙酸鹽、倍氯米松、氫化可的松)的殘留檢測方法。樣品經乙酸乙酯提取后，過硅膠固相萃取柱凈化，最后用乙腈定容，LC-MS/MS測定。方法的LOD為0.2～1.0μg/kg，LOQ為0.5～2.0μg/kg；添加回收率范圍為85.0%～96.4%，RSD為2.3%～6.1%。Shearan等開發了牛肉、腎臟、肝臟和脂肪組織中地塞米松的檢測方法。牛肉、腎臟、肝臟用乙酸乙酯提取，脂肪用乙醚提取，經凈化后，用高效液相色譜(HPLC)檢測。該方法的LOD可達到0.01mg/kg。Mazzarino等通過調節pH后，采用甲基叔丁基醚提取尿液中的16種合成GCs，經LC-MS/MS測定，方法LOD在1～50ng/mL之間。Earla等采用甲基叔丁基醚提取兔眼組織中的地塞米松和潑尼松龍，凈化后用LC-MS/MS測定。地塞米松和潑尼松龍的LOQ為2.7ng/mL和11.0ng/mL，日內和日間精密度為13.3%和11.1%，準確度為19.3%和12.5%。Zou等利用乙醚-環己烷混合溶液提取血漿中的倍他米松，在0.5mL血漿中加入3mL乙醚_環己烷(4+1，v/v)，渦動混合3min，4000r/min離心10min，有機層氮氣吹干，150μL流動相復溶，LC-MSMS分析。該方法的回收率為92.5%～106.5%，LOQ為0.1ng/mL。Salem等采用乙醚-環已烷提取血液中的倍他米松及其乙酸和磷酸酯，固相萃取凈化后，LC-MS/MS測定。倍他米松的LOD為0.50ng/mL，其乙酸酯的LOD為1.00ng/mL，在2.0～200.0ng/mL范圍呈良好線性。鄒曉春等0用乙酸鈉-乙酸緩沖溶液勻漿，超聲振蕩，對肉中5種GCs進行提取，再用HLB固相萃取小柱凈化，LC-MS/MS測定。在不同濃度水平下各GCs的平均加標回收率均在86.2%～102.8%之間，相對標準偏差(RSD)均小于10.4%；LOD為0.026～0.093μg/kg，LOQ在0.087～0.31μg/kg之間。

2)加壓溶劑萃取(pressurized liquid extraction，PLE)

PLE是指在較高的溫度(50～200℃)和壓力(1000～3000psi或10.3～20.6MPa)下，用溶劑萃取固體或半固體樣品的新穎的樣品前處理方法。與傳統提取方式相比，PLE速度快、溶劑用量少、萃取效率高、待測組分回收率好，可實現全自動安全操作。Chen等建立了牛、豬、羊可食組織中8種GCs(潑尼松、潑尼松龍、氫化可的松、甲基強的松龍、地塞米松、倍他米松、丙酸倍氯米松和氟氫可的松)的測定方法。以正己烷-乙酸乙酯(50+50，v/v)為提取溶劑，在1500psi和50℃下進行加壓溶劑萃取，再進行LC-MS/MS分析。在0.5～6μg/kg添加濃度范圍內，方法回收率在70.1%～103.1%之間，LOQ在0.5～2μg/kg之間。

3)超聲輔助萃取(ultrasound-assisted extraction，UAE)

UAE是利用超聲波輻射壓強產生的強烈機械振動、擾動效應、乳化、擴散、擊碎和攪拌等多級效應，增大物質分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標成分進入溶劑，促進提取的進行。優點是萃取速度快，價格低廉、效率高。崔曉亮等利用UAE提取牛奶中的12種GCs。稱取5.0g均勻的牛奶試樣，置于50mL離心管中，加入10mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.2mol/L，pH5.20)和35mL甲醇，超聲振蕩5min，于0℃下10000r/min離心10min，正己烷脫脂，固相萃取柱凈化，LC-MS/MS分析。該方法的LOD為0.02～0.38μg/kg，LOQ為0.07～1.27ug/kg，回收率為69.3%～94.3%，RSD為3.5%～16.7%。Caretti等采用三氟乙酸溶液在UAE條件下提取牛奶中的13種GCs，經富集和凈化后，用LC-MS/MS測定，地塞米松-D4為內標定量。方法回收率超過70%，日內精密度小于12%。

4)固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)

SPME是在固相萃取技術.上發展起來的一種微萃取分離技術，是一種集采樣、萃取、濃縮和進樣于一體的無溶劑樣品微萃取新技術。與固相萃取技術相比，SPME操作更簡單，攜帶更方便，操作費用也更加低廉；另外，克服了固相萃取回收率低、吸附劑孔道易堵塞的缺點。Ebrahimzadeh等報道了采用基于載體介導轉運的三相中空纖維微萃取技術提取牛奶、血清中地塞米松磷酸鈉的方法。以含有5% (w/v) Aliquate-336的正辛醇作為載體，將地塞米松磷酸鈉從7.5mL pH3酸性溶液(源相)萃取到有機相中，并含浸在中空纖維的孔中，最后再用24uL pH9.5位于中空纖維內腔里面(接收相)的堿性溶液萃取。提取基于從源相到接收相抗衡離子的梯度而發生。作者對影響提取效率的參數進行優化。在優化條件下，預濃縮因子為276，LOD為0.2μg/L，線性范圍為1～1000μg/L，RSD小于7.2%。

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