喹諾酮類藥物殘留分析技術前處理方法——提取方法

時間：2023-03-25 02:17:52來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

喹諾酮類藥物殘留分析技術前處理方法——提取方法

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

QNs的分析方法也受到了較大的關注，有關其分析方法的報道也日益增多。近年來，已有多篇文章專門對QNs的分析方法進行了綜述。

11.1.4.1 前處理方法

(1)提取方法

QNs殘留分析主要采用液液萃取(LLE)的提取方法。近年來，一些新的提取技術，如超聲輔助萃取(UAE)、加速溶劑萃取(ASE)、微波輔助萃取(MAE)、超臨界流體萃取(SFE)、分散液液微萃取(DLLME)等也開始應用到QNs殘留的提取中。

QNs屬于兩性化合物，不溶于非極性溶劑，溶于極性有機溶劑以及水溶性有機溶劑或酸性、堿性水溶液中。在組織樣品提取過程中，通常采用振蕩等操作來完成的，有時也使用超聲、均質等方法，大部分方法的提取需要重復兩次進行，使用的提取溶劑5～100mL不等。常用的有機溶劑包括乙酸乙酯、丙酮、乙腈、乙醇、甲醇、三氯甲烷或二氯甲烷、乙腈-水溶液等。常用的酸(堿)性有機溶劑包括：磷酸-乙腈、乙酸-乙腈、三氯乙酸-乙腈、高氯酸-乙腈、氨水-乙腈、乙酸-甲醇、三氯乙酸-甲醇、HCIO4-H3PO4-甲醇、三氯乙酸溶液等。常用的水溶液包括：10%高氯酸水溶液、磷酸水溶液、HCI溶液、EDTA-Mcilvaine緩沖液、磷酸鹽緩沖溶液、甲酸銨緩沖液(pH3.25)、NaOH溶液等。

1)液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

由于QNs為酸堿兩性物質，LLE方法通過調節水相的pH來使得被分析物由其中一相轉移到另一相，從而實現分析物的提取。Tyczkowska等研究發現，使用堿化溶劑處理奶樣品時，堿化溶劑有助于藥物的釋放。使用酸化或堿化的乙腈/甲醇提取ENR、CIP等QNs時，較使用單純有機溶劑的效果要強，提取雜質少，回收率高。Roybal等專門研究了甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷等對組織中SAR、DAN、ENR和CIP等QNs的提取效率。實驗發現，使用酸化的甲醇或酸化的丙酮(pH3.0)較單一或混合純有機溶劑能有效改善提取效率，回收率可達70%～90%，可能是在酸性條件下，質子化的QNs與樣品基質的吸附作用減弱的緣故，利于藥物的釋放。

氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等常用作LLE的溶劑，也可用緩沖液與三氯甲烷或二氯甲烷合并進行提取和凈化QNs，有時還可加入NaCl等以增強溶劑的離子強度進一步提高QNs在有機相中的轉移效率，但處理過程復雜、費時，并需要大量的有機溶劑。乙酸乙酯適用于多種基質中QNs的提取，特別是第一代和第二代QNs的提取(如OXO、FLU等)，乙酸乙酯的用量一般為20～100mL，采用普通的渦動混合或振蕩即可完成提取。QNs為酸堿兩性物質，介質中水分含量約1%時，對QNs的解離狀態具有調節作用，無水硫酸鈉常被用來提高乙酸乙酯的提取效率，無水硫酸鈉的使用量影響待測物的回收率，5mL樣品中加入4g無水硫酸鈉時，乙酸乙酯的提取效率最高140。Meinertz等發現，使用乙腈-水(1+1，v/v)提取鯰魚組織中的SAR及其他QNs時，乙腈-水不但可以有效溶解和提取SAR，而且提取雜質較少。另外，從樣品基質提取后，通常會用正己烷、乙醚等非極性溶劑進行脫脂。

Schneider等用LLE法凈化雞組織中的CIP、ENR、DAN、SAR、DIF、NOR、ORB和去乙烯基環丙沙星(desethylene ciprofloxacin)。1.0g組織中加入3mL乙腈和0.25mL濃氨水，均質后離心5min(肝臟：2205g；肌肉：2791g)，取上清液。重復提取2次，合并上清液于50mL離心管中，加入3mL正已烷、3mL乙醚和0.25mL1mol/L氯化鈉溶液，渦動混合15s，取下層溶液置于玻璃管中，40℃水浴中氮氣吹干，吹干后在玻璃管中加入2.0mL 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH9.0)，渦動15s復溶，過濾后LC分離，熒光檢測器定量，多級串聯質譜(MSn)確證。在10～200ng/g的添加水平，回收率為60%～93%，去乙烯基環丙沙星、NOR、CIP、DAN、ENR、ORB、SAR和DIF在肝臟組織中的檢出限(LOD)分別為0.3ng/g、1.2ng/g、2ng/g、0.2ng/g、0.3ng/g、1.5ng/g、2ng/g、0.3ng/g；肌肉組織中的LOD分別為0.1ng/g、0.2ng/g、1.5ng/g、0.1ng/g、0.2ng/g、0.5ng/g、0.6ng/g、0.2ng/g。

2)超聲輔助萃取(ultrasound-assisted extraction，UAE)

UAE是利用超聲波輻射壓強產生的強烈機械振動、擾動效應、乳化、擴散、擊碎和攪拌等多級，效應，增大物質分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標成分進入溶劑，促進提取的進行。優點是萃取速度快、價格低廉、效率高。王金秋等利用UAE提取豬肌肉中13種QNs，樣品用8mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液超聲提取15min，10000r/min離心5min，殘留組織用磷酸鹽緩沖液(pH7.4)重復提取1次，合并上清液，提取液超聲15min，10000r/min離心5min，HLB柱固相凈化，超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)測定；13種藥物在5.0ug/kg、50.0ug/kg、100.0μg/kg三個濃度水平添加，回收率為64.55%～117.62%，日內變異系數(CV)小于14.28%，日間CV小于12.81%，LOD均為1.0μg/kg，定量限(LOQ)均為5.0μg/kg。劉輝等用UAE提取水產品樣品中QNs和磺胺類藥物，3.00g樣品加入3.0g無水硫酸鈉和15.0mL乙腈-乙酸乙酯(3+2，v/v)混合液，高速渦旋振蕩混合30s，超聲10min，12000r/min離心5min，氨基SPE柱凈化，UPLC-MS/MS檢測。14種藥物的LOD均為1μg/kg，回收率為81.2%～116%，相對標準偏差(RSD)為0.72%～9.8%。

3)超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，SFE)

SFE是用超臨界流體作為萃取劑，從各種組分復雜的樣品中，把所需要的組分分離提取出來的一種分離萃取的新技術。超臨界流體的性質介于氣體和液體之間，既有液體的高密度，能溶解各種不溶于氣體的物質，又有氣體的黏度小、滲透力強等特點，可以快速、高效地將被測物從樣品基質中萃取出來。超臨界流體萃取具有萃取效率和選擇性高、省時、萃取溶劑(如CO2)易揮發、提取物較為“干凈”、環境污染少、操作條件易于改變等特點。Shen等采用SFE分離雞肌肉組織中的NOR和OFL，使用含20%甲醇(v/v)的超臨界CO2，溫度為80℃，壓力為300大氣壓，流速為3mL/min，收集萃取液40℃旋轉蒸干，10mL流動相復溶，高效液相色譜(HPLC)分析，NOR和OFL的回收率為70%～87%，LOQ為5ng/g。

4)分散液液微萃取(dispersive liquid liquid microextraction，DLLME)

DLLME是將合適的分散劑和萃取劑的混合溶劑通過微量進樣器快速注入到樣品溶液中，萃取溶劑以微滴形式分散在溶液中形成渾濁溶液，此時樣品溶液中的目標分析物被萃取到萃取劑微滴中。然后，通過離心實現相分離，富集有目標分析物的萃取劑沉積于溶液底部。最后，使用微量進樣器移取沉積相注入色譜儀器進行分析檢測。DLLME方法操作簡單、快速、成本低、富集倍數大，現已成功應用于多種痕量有機物的分析檢測。Tsai等建立了DLLME方法凈化豬肌肉組織中的SAR、DAN、NAL、OXO、ENR、FLU和哌啶。5g組織置于50mL離心管，加入5mL乙腈(含50μL 70%～72%高氯酸)，均質器均質后，加入2g無水硫酸鎂和1g氯化鈉，振蕩混合1min，10000r/min離心4min，取1.5mL含有300μL二氯甲烷(作為提取溶劑)的上層乙腈溶液(作為分散溶劑)快速注入有7.5mL純水的10mL試管，渦動混合30s，3000r/min離心4min，用1mL注射器將澄清溶液轉移至小瓶，少量甲醇洗滌注射器2次，洗滌液放入同一小瓶，40℃氮氣吹干，500μL水-乙腈-高氯酸(70%～72%)混合溶液(10+2+88，v/v/v)復溶，過0.45μm濾膜，HPLC分析。方法回收率和LOD分別為93.0%～104.7%和5.6～23.8μg/kg。Moema等采用DLLME方法提取雞肝樣品中的6種QNs。對分散劑類型和用量，提取劑類型和用量以及分散劑中磷酸濃度和組成、pH等參數進行了優化，凈化后HPLC分析。線性范圍為30～500μg/kg，相關系數范圍為0.9945～0.9974；標準偏差(SD)為4%～7%，在三個濃度水平(50μg/kg、100μg/kg和300μg/kg)的添加回收率為83%～102%；LOD和LOQ分別為5～19μg/kg和23～62μg/kg。Alexandra等建立了DLLME-UPLC-MS/MS法檢測原料乳中的17種QNs和14種β-內酰胺類藥物(青霉素和先鋒霉素)，并根據歐盟在決議2002/547/EC對方法進行驗證。DLLME萃取效率取決于多項參數，如萃取物和分散溶劑的性質、體積、pH、鹽濃度、攪拌時間和離心時間。采用多變量優化法對這些變量進行準確優化。Plackett-Burman設計選擇出影響最大的參數，Doehlert設計獲取最優條件并應用條件，用兩種不同的pH萃取目標組分(酸性QNs和β-內酰胺類pH為3，其他QNs的pH為8)，使用基質匹配標準曲線定量，羥氨芐青霉素LOQ為0.3ng/g，CIP為6.6ng/g，CV低于15%，檢測限(CCa)為4.1～104.8ng/g，檢測能力(CCβ)為4.2～109.7ng/g，這些值均很接近于此研究中目標藥物的MRL，回收率為72%～110%。

5)微波輔助萃取(microwave-assisted extraction，MAE)

MAE是利用微波加熱的特性對物料中目標成分進行選擇性萃取的方法。它是通過調節微波加熱的參數，利用極性分子可迅速吸收微波能量的特性來加熱一些具有極性的溶劑，對樣品進行微波加熱，這樣可有效加熱目標成分，以利于目標成分的萃取和分離。由于微波加熱是利用分子極化或離子導電效應直接對物質進行加熱，且是由內及外的內部加熱，因此熱效率高、升溫快速均勻，大大縮短了萃取時間，提高了萃取效率。Hermo等對傳統提取方法和MAE提取豬肌肉組織中QNs進行了比較。實驗結果表明，MAE的凈化效果更好、雜質干擾少，可以獲得比傳統提取方法略低的LOD和LOQ。

徐昊妍建立了QNs殘留的MAE方法。5.0g雞肌肉樣品置于50mL聚四氟乙烯微波罐中，加入7.5mL水勻質后，加入17.5mL 0.3%磷酸乙腈，25mL正已烷，微波60℃，15min，以4500r/min離心10min，收集上清液于50mL分液漏斗中。將離心后的雞肉殘渣用5mL 0.3%磷酸乙腈溶液淋洗，合并上清液。上清液于50℃下用N2吹干后，用2mL流動相定容，過0.45μm微孔濾膜后，液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)測定。方法回收率為66%～97.2%，日內和日間的SD分別為0.95%～10.4%和3.8%～13.6%，LOD為2.7～6.7ng/g。

6)加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction，ASE)

ASE是利用在--定溫度和壓強下，溶劑所具有的特殊物理化學性質來對固體和半固體物質進行萃取，也稱為加壓液體萃取(pressurized liquid extraction，PLE)、加壓流體萃取(pressurized fluid extraction，PFE)或增強的溶劑萃取(enhanced solvent extraction，ESE)。該方法具有速度快、溶劑使用量少、重復性好等特點。厲文輝等采用ASE提取魚肉中的QNs(OFL、NOR、CIP、SAR、FLE、LOM、DIF、ENR)、磺胺與大環內酯類藥物。將草魚等樣品去皮、去骨，切碎后勻漿，冷凍干燥處理后，經研缽研磨均勻。稱取0.10g干魚樣品，加入1.5g硅藻土混合均勻，萃取池(34mL)底部鋪上1cm厚的硅藻土層，將混勻好的樣品填入萃取池，并加入20ng替代物。萃取條件壓力10.34MPa、溫度70℃、靜態萃取時間5min、沖洗溶劑體積為池容積的60%、氮氣吹掃時間120s、靜態循環2次。將萃取池置于ASE350上，進行加溫加壓萃取。收集的萃取液轉移至心形瓶，37℃水浴真空旋轉蒸發至不再有餾出物。向心形瓶中加入100mL超純水溶解提取物，渦旋振蕩后搖勻，HLB固相萃取柱凈化，C18柱對藥物進行分離，LC-MS/MS檢測。22種QNs、磺胺和大環內酯類抗生素藥物的回收率為66%～120%，RSD分別為0.7%～16%，方法LOD為0.02～0.6μg/kg。Rodriguez等采用PLE提取嬰兒食品中的NOR、CIP、LOM、DAN、ENR和SAR。提取溶液為乙腈～50mmol/L pH3.0磷酸溶液(80+20，v/v)，萃取溫度為80℃，萃取壓力2000psi，靜態萃取時間5min，靜態循環3次。結果QNs的回收率為69%～107%。Herranz等采用PLE提取食用蛋中的CIP、SAR和ENR。提取溶液為乙腈-50mmol/L pH3.0磷酸鹽溶液(50+50，v/v)，設置萃取條件為壓力1500psi，溫度70℃，靜態萃取時間5min，沖洗溶劑體積為池容積的50%，靜態循環3次。結果回收率為67%～90%，RSD低于17%，CCa為17～24ng/g，CCβ為30～41ng/g。Yu等采用ASE提取動物源食品中15種QNs(MAR、ENO、FLE、OFL、PEF、LOM、DAN、ENR、ORB、CIN、DAT、SAR、DIF、NAL和FLU)，優化了萃取溫度和壓力、ASE次數等。提取后用Oasis HLB柱凈化，HPLC與LC-MS/MS同時測定。添加濃度為10～800μg/kg時，HPLC測定QNs在豬和牛肌肉、肝臟和腎臟以及雞和魚等樣品中的的添加回收率范圍為70.6%～111.1%，RSD小于15%；在HPLC方法中15種QNs的LOD和LOQ分別為3μg/kg和10ug/kg，而在LC-MS/MS方法中分別為0.3ug/kg和1μg/kg。

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