四環素類藥物殘留分析技術——測定高效液相色譜法（二）

時間：2023-03-25 02:16:19來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

四環素類藥物殘留分析技術——測定高效液相色譜法（二）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

2)熒光檢測器(fluorescence detection，FLD)

在一定pH范圍內，TCs及其部分衍生物可以產生熒光，因此可用熒光測定。TCs與一些金屬離子有很強的整合能力，并能生成有色整合物，其中以鈾、鋅、銅、鋁、鎂等離子的整合物尤為穩定，可用于鑒別、測定TCs的含量。一些整合物在一定pH條件下的熒光強度增強，為熒光測定提供了基礎。

Lu等報道了采用HPLC-FLD同時測定OTC、DC、TC和CTC的方法。用反相C18色譜柱分離，甲醇-醋酸鈉緩沖液(含乙二胺四乙酸二鈉和氯化鈣，pH8.1)作流動相，梯度洗脫，FLD在激發波長(λex)380nm，發射波長(λem)532nm測定。OTC、DCTC和CTC的LOD分別為0.1ug/L、0.5ug/L、0.3μg/L和0.4ug/L。Spisso等建立了檢測牛奶中OTC、TC、CTC的HPLC-FLD方法。以Symmetry Shield TM RP8色譜柱(150mm×4.6mmi.d，3.5μm)分離，流動相為0.01mol/L草酸和乙腈，流速為1mL/min，梯度洗脫，用醋酸鎂在二甲基甲酰胺中的柱后衍生增強熒光，FLD檢測，λex=385nm，λem=500nm。方法的回收率為61%～115%，CV為5%～15%；測得牛奶中OTC、TC、CTC的LOD為5～35μg/kg，LOQ為50ug/kg，CCa分別為109μg/kg、108μg/kg和124μg/kg，CCβ分別為119μg/kg、117μg/kg和161μg/kg。Schneider等對雞肉中OTC、CTC、TC進行HPLC-FLD檢測。以0.1mol/L丙二酸鹽(含50mmol/L mg2+，濃氨水調pH6.5)和甲醇為流動相，梯度洗脫，流速為0.5mL/min，XDB-苯基色譜柱(3.0mm×150mm，3.5μm)分離，FLD檢測，λex=375nm，λem=535nm。方法回收率為63%～95%，OTC、TC、CTC的LOD分別為1ng/g、1.5ng/g和5ng/g，在無需柱后衍生的前提下該方法可獲得較強的熒光。Peres等建立了HPLC-FLD方法檢測蜂蜜中的OTC、TC和CTC用Na2EDTA-Mclvaine緩沖溶液提取，SPE凈化，XDB-C8色譜柱(4.6mm×250mm，5um)分離，流動相A為0.075mol/L二水乙酸鈉、0.035mol/L二水氯化鈣、0.025mol/L Na2EDTA，用5mol/L氫氧化鈉調pH6.5，流動相B為甲醇-水(95+5，v/v)，梯度洗脫，FLD檢測，λex=390nm，λem=512nm。方法的回收率為86%～111%，CV低于11%；L0D和LOQ分別為8ug/kg和25μg/kg。

3)化學發光檢測器(chemiluminescence detection，CLD)

CLD是近年來發展起來的一種快速、靈敏的新型檢測器，具有設備簡單、價廉、線性范圍寬等優點。其原理是分離組分從色譜柱中洗脫出來后，與適當的化學發光試劑混合，引起化學反應，導致發光物質產生輻射，其光強度與該物質的濃度成正比。CLD不需要光源，也不需要復雜的光學系統，只要有恒流泵，將化學發光試劑以一定的流速泵入混合器中，使之與柱流出物迅速而又均勻地混合產生化學發光，通過光電倍增管將光信號變成電信號，就可進行檢測。

張琰圖等基于TCs能夠強烈增敏通過恒電流電解方法在線電生BrO和魯米諾之間產生的化學發光，建立了HPLC分離，柱后化學發光檢測牛奶中TC、OTC、CTC和DC的方法。準確移取5mL鮮奶于10mL容量瓶中，加入乙腈混勻后靜置10min，然后10000r/min離心，將上清液移入25mL容量瓶中用乙腈洗滌定容。以NucleosilRP-C18(250mm×4.6mm，i.d，5μm)為色譜柱，0.05mol/L磷酸二氫鉀(pH2.5)-乙腈(30+70，v/v)為流動相，流速1.2mL/min，柱溫25℃。將一根長為10cm的無色玻璃管(內徑為2mm，外徑為3.5mm)加工纏繞成直徑為0.8cm的平面螺旋管作為檢測流通池并將其放置在光電倍增管前面，使用恒流泵分別將電解液和魯米諾溶液以2.0mL/min的流速通過相應的管道泵入分析系統，同時開啟恒電位儀(控制電解電流為0.2 mA)和高壓泵，待基線平穩后，用進樣器將20μL的TC、OTC、CTC、DC標準液(或樣品溶液)注入色譜柱，經色譜柱分離后與魯米諾及電生的BrO-溶液混合，在流通池中產生化學發光，記錄色譜圖，根據色譜峰高進行定量分析。該方法LOD為0.002～0.008μg/mL，回收率為90%～115%，RSD為2.0%～3.6%。Morandi等開發一種基于銪敏化發光檢測的HPLC方法，用于測定牛奶中的TC殘留。鑭系元素陽離子的電子發射性能被用作銪(II)絡合TC指紋。提取和純化過程的優化提供了一種簡單和方便的途徑來制備穩定的TC樣品，可以安全地抵抗冷凍循環。該方法首次用于牛奶中TC的測定，各項性能指標滿足歐盟指令2002/657/EC的要求，假符合率(β錯誤)低于5%。

Wan等利用TCs可增強高錳酸鉀亞硫酸鈉-B-環糊精體系在磷酸溶液中的化學發光強度，建立了蜂蜜中OTC、TC和MTC的HPLC-CLD方法。以檸檬酸和磷酸鹽溶液提取，XAD-2樹脂柱凈化，XDB-C18色譜柱分離，乙腈和0.001mol/L磷酸為流動相，CLD檢測。該方法用于蜂蜜中TCs的分析，線性為0.5～1000.0ng/mL，LOD為0.9～5.0ng/mL，日內RSD為3.1%～7.4%，日間RSD為2.2%～8.6%。

Valverde等報道了采用HPLC-CLD測定水樣中TC、OTC、CTC、DMCT、DC和MCC的分析方法。CLD測定基于在硫酸介質中光照射TC會增強鈰(IV)-羅丹明B系統的化學發光。采用Aquasil-C18色譜柱分離，乙腈和0.1mol/L磷酸緩沖液梯度洗脫，使用光反應器組成的PFA管式反應器線圈和8W氙氣燈進行光衍生化。方法日內RSD小于10%，LOD在0.12～0.34μg/L之間。

4)電化學檢測器(electrochemical detection，ECD)

ECD主要有安培、極譜、庫侖、電位、電導等檢測器，屬選擇性檢測器，可檢測具有電活性的化合物。目前它已在各種無機和有機陰陽離子、生物組織和體液的代謝物、食品添加劑、環境污染物、生化制品、農藥及醫藥等的測定中獲得了廣泛的應用。Zhao等采用HPLC-庫侖電極陣列法檢測牛奶中的OTC、TC、CTC、MTC和DC。牛奶樣品用1mol/L鹽酸調pH4.0，超聲5min，8000g離心10min，取上清液，30mL正已烷萃取2次，取下層的水相。有機相用2mL水洗滌1次，水相真空旋蒸低于10mL，甲醇定容至10mL，0.22um濾膜過濾，取20μL進樣，HPLC-庫侖電極陣列法分析。色譜柱為C18反相柱(150mm×4mmi.d，5um)，流動相為二水磷酸二氫鈉溶液(pH2.2，0.05mol/L)-乙腈(78+22，v/v)，流速為1mL/min；四電極的點位分別為400mV、660mV、680mV和700mV，第一個電極用于去除共萃取的干擾物質，其他3個電極用于定量，檢測的最大電位為700mV。該方法的回收率為88%，CV低于4.3%，OTC、TC、CTC、MTC和DC的LOD分別為12.5ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、10ng/mL和25ng/mL。

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