液相色譜-紫外檢測法測定蜂蜜中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

12.2.2.1 適用范圍

蜂蜜中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量的測定。方法檢出限：土霉素、四環素、金霉素、強力霉素均為0.010mg/kg。

12.2.2.2 方法原理

蜂蜜試樣中四環素族抗生素殘留用0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine(pH=4.0±0.05)緩沖溶液提取，經離心后，上清液用OasisHLB或相當的固相萃取柱和陰離子交換柱凈化，紫外檢測器高效液相色譜儀測定，外標法定量。

12.2.2.3 試劑和材料

甲醇、乙腈：一級色譜純；磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)：優級純；乙酸乙酯：分析純，重蒸餾；檸檬酸(C6H8O7·H2O)、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)、草酸：分析純。

磷酸氫二鈉溶液：0.2mol/L。稱取28.41g磷酸氫二鈉，用水溶解，定容至1000mL；檸檬酸溶液：0.1mol/L。稱取21.01g檸檬酸，用水溶解，定容至1000mL；Mcllvaine緩沖溶液：將1000mL0.1mol/L檸檬酸溶液與625mL 0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液混合，必要時用NaOH或HCl調pH=4.0±0.05；4.11 Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液：0.1mol/L。稱取60.5g乙二胺四乙酸二鈉放入1625mL Mcllvaine緩沖溶液中，使其溶解，搖勻；甲醇+水(1+19，v/v)：量取5mL甲醇與95mL水混合。

土霉素、四環素、金霉素、強力霉素標準物質：純度≥95%。

土霉素、四環素、金霉素、強力霉素標準溶液：0.1mg/mL。準確稱取適量的土霉素、四環素、金霉素、強力霉素標準物質，分別用甲醇配成0.1mg/mL的標準儲備液。儲備液貯存在-18℃。根據需要用流動相逐級稀釋成適當濃度的混合標準工作溶液，混合標準工作溶液在4℃保存，可使用3天。

OasisHLB固相萃取柱或相當者：500mg，6mL。使用前分別用5mL甲醇和10mL水預處理，保持柱體濕潤。

陰離子交換柱：羧酸型，500mg，3mL。使用前用5mL乙酸乙酯預處理，保持柱體濕潤。

12.2.2.4 儀器和設備

高效液相色譜儀：配有紫外檢測器；分析天平：感量0.1mg，0.01g；液體混勻器；固相萃取真空裝置；貯液器：50mL；微量注射器：25μL，100μL；刻度樣品管：5mL，精度為0.1mL；真空泵：真空度應達到80kPa；離心管：50mL；平底燒瓶：100mL；pH計：測量精度±0.02。

12.2.2.5 樣品前處理

(1) 試樣制備

對無結晶的實驗室樣品，將其攪拌均勻。對有結晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過60℃的水浴中溫熱，振蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫。分出0.5kg作為試樣。制備好的試樣置于樣品瓶中，密封，并標明標記。將試樣于常溫下保存。

(2) 提取

稱取6g試樣，精確到0.01g。置于150mL三角瓶中，加入30mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，于液體混勻器上快速混合1min，使試樣完全溶解。樣液倒入50mL離心管中，以3000r/min離心5min，待凈化。

(3) 凈化

將上清液倒入下接OasisHLB柱或相當者的貯液器中，上清液以≤3mL/min的流速通過Oasis或相當的固相萃取柱，待上清液完全流出后，用5mL甲醇-水洗柱，棄去全部流出液。在65kPa的負壓下，減壓抽干20min，最后用15mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于100mL圓底燒瓶中。

按上述方法使洗脫液在減壓情況下以≤3mL/min的流速通過陰離子交換柱，待洗脫液全部流出后，用5mL甲醇洗柱，棄去全部流出液。在65kPa負壓下，減壓抽干5min，再用4mL流動相洗脫，收集洗脫液于5mL樣品管中，定容至4mL，供液相色譜儀測定。

12.2.2.6 測定

(1)液相色譜條件

色譜柱：μBondapakC18，10μ，300mm×3.9mm或相當者；流動相：乙腈+甲醇+0.01mol/L草酸溶液(20+10+70，v/v/v)；流速：1.5mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：350nm；進樣量：100μL。

(2)液相色譜測定

根據樣品溶液中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素含量的情況，選定峰高相近的標準工作溶液，標準工作溶液和樣品溶液中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素的響應值均應在儀器測定的線性范圍內。對標準工作溶液和樣品溶液等體積參差進行測定。在上述色譜條件下，土霉素、四環素、金霉素、強力霉素色譜峰的分離度應大于1.2，其參考保留時間分別是4.0min、4.8min、9.6min、14.0min。土霉素、四環素、金霉素、強力霉素標準物質色譜圖見圖12-4。

圖12-4 土霉素、四環素、金霉素、強力霉素標準物質色譜圖.

4.027min，土霉素：4.757min，四環素；9.578min，金微素：14.015min，強力霉素

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