吡唑酮類藥殘留分析技術前處理——凈化方法

時間：2023-03-25 00:56:39來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

吡唑酮類藥殘留分析技術前處理——凈化方法

[db:作者] / 2022-12-20 00:00

(3)凈化方法

吡唑酮類藥物殘留分析的凈化方法主要采用液液分配(LLP)和固相萃取(SPE)方法。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP主要通過調節溶液的pH，改變吡唑酮類藥物在水相和有機相中的分配系數，從而達到去除脂溶性和水溶性雜質的目的。

Clark等用LC-MS確證牛腎臟中的保泰松，利用保泰松的酸性特性，樣品用等質量的水稀釋后，用25%氨水堿化，加入乙酸乙酯-乙醚混合溶液進行LLP，離心，棄去有機層，脫去脂溶性雜質，然后用6mol/L HCI酸化氨水提取液，再與四氫呋喃-正己烷(1+4，v/v)進行LLP，將藥物轉移至有機相，棄去水溶性雜質，然后進行固相萃取凈化，LC-MS確證檢測。方法LOD為5～10μg/kg，但未測定回收率。

Shively等測定唾液中安替比林和氨基比林，1mL樣品加1mL 1mol/L氫氧化鈉溶液堿化稀釋，再與1mL氯仿LLP提取凈化，收集下層的氯仿提取液，蒸干后復溶于二氧己環，進GC測定。安替比林和氨基比林的線性范圍均為0～10μg/mL，CV分別為1.7%和2.4%，回收率為87%和95%。

由于安乃近代謝物極性強，在固相萃取柱上保留很弱，經過固相萃取柱凈化損失較大，因此沈金燦等在測定牛奶和奶粉中安乃近的4個代謝物(FAA、AAA、MAA和AA)殘留時，在樣品加入Tris溶液后，用乙腈提取，乙腈提取液與正已烷進行LLP脫脂，提取液中的脂肪得到有效去除。MAA的LOD為0.24ug/kg，AA為0.59ug/kg，AAA為0.20μg/kg，FAA為0.61μg/kg。在添加量5～20ug/kg范圍內，4種安乃近代謝物的回收率在80.4%～97.9%之間，RSD均小于9%。Penney 等測定牛奶、牛肉、豬肉中安乃近及其代謝物殘留時，直接用甲醇提取，提取液與正己烷LLP脫脂后直接進HPLC分析。牛奶和豬肉樣品的CV小于11%，牛肉樣品稍大；平均回收率為82%～128%， FAA、AA和MAA的LOD均小于0.02mg/kg，安乃近的LOD小于0.13mg/kg。

2)固相萃取(solid phase extraction， SPE)

根據吡唑酮類藥物酸堿性和極性的差異，選擇不同的SPE柱進行凈化。酸性的保泰松、羥布宗等主要采用C18、苯基、硅膠、硅酸鎂、氨基柱、HLB等SPE柱凈化，堿性的安替比林、安乃近代謝物等主要采用C18、氧化鋁等SPE柱凈化。

A. 酸性藥物

a. 反相SPE柱

保泰松和羥布宗顯酸性，在酸性條件下，增加了反相色譜保留作用，改善了凈化效率。Taylor等測定馬血漿中保泰松和羥布宗，血漿用PBS溶液稀釋后，用C18 SPE柱凈化，依次用PBS溶液和正已烷淋洗，用乙酸乙酯-正己烷(1+1，v/v)洗脫，HPLC測定。保泰松和羥布宗的回收率分別為53.5%～63.1%和43.3%～47.2%，CV分別為5.1%和4.0%。液態樣品可直接用中性或酸性溶液稀釋后過SPE凈化，操作較為簡單。Simmons等提取血清中保泰松和羥布宗，三氯乙酸提取液上C18小柱凈化，用水淋洗，甲醇洗脫，SFC測定。保泰松和羥布宗的LOD分別為0.1μg/mL和1.0μg/mL，CV為0.24%～4.94%，回收率在82%～83%之間。Caturla等測定血漿中保泰松和羥布宗，應用檸檬酸緩沖液調節血漿pH3.4，上苯基SPE柱凈化，用正已烷-乙醚(1+1，v/v)洗脫，洗脫液吹干后流動相溶解，HPLC測定。方法回收率大于90%，CV小于7.5%。該方法的優點是應用檸檬酸緩沖溶液可避免鹽酸提取時引起的藥物降解。

Dowling等報道了牛乳中保泰松殘留分析方法。乙腈提取液用等體積的10 mmol/L的維生素C溶液稀釋，再用1mol/L鹽酸調節pH3后，上Isolute C18 SPE柱凈化，依次用3 mL 10 mmol/L維生素C溶液和甲醇-水(10+90，v/v)淋洗，抽干后用3mL正己烷-乙醚(50+50，v/v)洗脫。方法的CCa和CCβ分別為0.70ng/mL和1.19ng/mL，回收率為105.3%，CV為6.7%。

Gentili 等測定牛奶和牛肉中保泰松等15種非甾體類抗炎藥物，牛奶用乙腈提取，牛肉用乙腈和丙酮提取，提取液濃縮后用水稀釋，過HLB SPE柱凈化，用6 mL正已烷淋洗，依次用甲醇和丙酮洗脫。LC-MS/MS 測定牛奶和牛肉中保泰松的CCa 分別為0.71 μg/kg和0.92 μg/kg，CCβ 分別為1.23 ug/kg和1.84 ug/kg，回收率在97%～99%之間。

b.正相SPE柱

Jedziniak等測定牛奶中的保泰松和羥布宗，乙腈提取液上氨基柱SPE凈化，用6mL甲酸-乙腈(5+95，v/v)洗脫，LC-MS/MS測定。實驗室內CV為7%～28%，回收率為71%～116%。

龐國芳等分析牛、豬、羊、雞肌肉中的保泰松殘留時，將甲醇-0.25mg/mL二硫蘇糖醇的乙酸乙酯溶液(1+7，v/v)提取液吹干后，用5 mL甲醇-氨水-二氯甲烷-0.25 mg/mL二硫蘇糖醇的乙酸乙酯溶液(1+1+70+70，v/v)溶解，過VARIAN Bond Elut FL (硅酸鎂，2g) SPE柱，15 mL冰乙酸-甲醇-二氯甲烷-乙醚溶液(1+2+47+50，v/v)洗脫，洗脫液用氮氣吹至近干后，用流動相溶解，進HPLC檢測。方法回收率為89.0%～111.49%，RSD在8%以內，LOD為5.0μg/kg。該研究還對甲醇、乙酸乙酯、甲醇-乙酸乙酯混合液作為SPE洗脫液的凈化效果進行了比較，發現甲醇洗脫會影響定量，采用冰乙酸-甲醇-二氯甲烷～乙醚溶液(1+2+47+50，v/v)洗脫雜質明顯減少，效果最好。

Clark等用LC-MS確證牛腎臟中的保泰松時，組織酸化后用四氫呋喃-正己烷(1+4，v/v)提取，提取液上硅膠SPE柱凈化，用四氫呋喃-正已烷(1+4，v/v)直接洗脫，確證LOD為5～10μg/kg，回收率未作測定。

正相機制SPE凈化，上樣樣品要盡量不要含有水分，否則影響回收率。

c. 復合SPE柱

Taylor等確證馬血漿中保泰松和羥布宗時，C18 SPE柱洗脫液吹干后，復溶于PBS緩沖液，再過Bond-Elut Certify柱(反相和陽離子交換復合填料)凈化，分別用甲醇-PBS緩沖液(1+9，v/v)、1.0mol/L乙酸和正己烷淋洗，二氯甲烷洗脫，衍生化后GC-MS確證測定。血液中添加濃度大于4μg/mL時，保泰松和羥布宗可得到確證。

B. 堿性藥物

a. 反相SPE柱

沈金燦等測定牛和豬肌肉組織中安乃近的3種代謝物FAA、AA和MAA殘留時，將2mL水相提取液加入Bond Elute C18 SPE中，依次用5mL水和5mL甲醇-水(5+95，v/v)淋洗，用5mL甲醇洗脫，LC-MS/MS測定。方法LOD為5μg/kg；測定范圍為5～150ug/kg；FAA、AAA、AA和MAA的回收率分別為81.6%～94.0%、81.2%～90.2%、82%～101%和75.0%～86.4%；CV小于7%。通過比較HLB、Bond Elute Certify、Bond Elute C18的富集和凈化效果，發現HLB柱對AA的回收率差，Bond Elute Certify對MAA的回收率差，而Bond Elute C18的回收率均比較理想。

b. 正相SPE柱

Jedziniak等測定牛肉中安乃近的4種代謝物(FAA、AAA、AA和MAA)殘留時，樣品的乙腈-乙酸鈉溶液提取液用氧化鋁SPE柱凈化，收集流出液進LC-MS/MS測定，回收率為45%～95%，CV為7%～30%；MAA的CCa和CCβ分別為113μg/kg和139μg/kg，FAA、AAA和AA的CCa和CCβ均在11.6～16.5μg/kg之間。

Engel等測定安替比林代謝物NORA時，體外肝微粒體酶孵育液用二氯甲烷提取，提取液蒸干后復溶于乙酸乙酯，過硅膠SPE小柱凈化，用6mL甲醇-乙酸乙酯(1+9，v/v)洗脫，棄去初始的2mL，收集后4 mL，衍生化后用GC-MS測定。NORA的LOQ為5 ng/mL，CV為19.4%和20.7%，回收率為80%～120%。因為安替比林、NORA與衍生化試劑N- (特丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺均生成相同的產物，干擾NORA測定。經過硅膠柱凈化，安替比林仍保留在SPE小柱上，只有NORA被洗脫，避免了測定時的干擾。

3)分子印跡技術(molecular imprinting technology，MIT)

分子印跡技術是一種制備分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)的技術。由于MIP中具有和目標分子高度互補的功能基團和空腔結構，因此具有對目標分子較好的識別性能。何云華等以甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，合成了安乃近的MIP。所制備的MIP與安乃近存在兩類不同的結合位點，高親和力結合位點的離解常數為9.52×10-4 mmol/L，最大表觀結合量67.0 umol/g；低親和力結合位點的離解常數為8.71×10-3 mmol/L，最大表觀結合量為240.0 umol/g。其對氨基比林及安替比林的吸附量均較小，表明制備的安乃近MIP具有良好的選擇性。

4)液相微萃取(liquid phase microextraction， LPME)

LPME過程是基于分析物在樣品與有機溶劑之間分配平衡的過程，分析物在平衡時的萃取量達到最大。黃星等建立了尿液中氨基比林和安替比林的LPME-GC測定方法。在4 mL萃取瓶中加入攪拌磁子和3mL尿樣，調節至pH9，用10μL微量注射器抽取1 μL甲苯，將針尖浸入到樣液高度一半處，按下微量注射器的活塞，使萃取溶液形成一個小液滴懸掛在針尖上，溶液攪拌速度為170 r/min，萃取15 min后，拉回活塞，直接進GC分析。氨基比林、安替比林的CV為8.14%～16.8%，LOD 分別為1mg/L、4mg/L。

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