液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛豬肝腎和肌肉組織中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

9.2.1.1 適用范圍

牛豬肝腎和肌肉組織中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、已烷雌酚、雙烯雌酚殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。方法檢出限：牛豬肝腎和肌肉組織中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烷雌酚為0.5μg/kg；己烯雌酚和雙烯雌酚為1.0μg/kg。

9.2.1.2 方法原理

試樣中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留，用叔丁基甲基醚和乙酸鹽緩沖溶液加酶解劑分別提取，硅膠固相萃取柱凈化后濃縮，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，保留時(shí)間和離子豐度比定性，內(nèi)標(biāo)法定量。

9.2.1.3試劑和材料

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正已烷、二氯甲烷、叔丁基甲基醚：色譜純；乙酸、乙酸鈉(CH3COONa：3H2O)：優(yōu)級(jí)純。

乙酸鹽緩沖溶液：0.2mol/L，pH=5.2。稱(chēng)取2.72g乙酸和12.95g乙酸鈉溶解于800mL水中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.2±0.1，加水定容至1000mL。

氫氧化鈉：優(yōu)級(jí)純；氫氧化鈉溶液：3mol/L。稱(chēng)取120g氫氧化鈉溶于1000mL去離子水中；

溶解液：正己烷+二氯甲烷(60+40，v/v)。量取60mL正已烷與40mL二氯甲烷混合。

淋洗液：乙酸乙酯+正已烷(6+94，v/v)。量取6mL乙酸乙酯與94mL正己烷混合。

洗脫液：乙酸乙酯-正己烷(60+40，v/v)。量取60mL乙酸乙酯與40mL正己烷混合。

β-葡糖苷酸酶：H-2型，含β-葡糖苷酸酶124400unit/mL，硫酸酯酶3610units/mL。

激素及代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，各50%)、玉米赤霉酮：純度≥97%；己烯雌酚，純度≥99%；己烷雌酚、雙烯雌酚：純度≥98%。

激素及代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配制成1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。再根據(jù)需要以甲醇配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用3個(gè)月。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：氘代玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇-4氘代和β-玉米赤霉醇-4氘代，各50%)，純度≥99%；己烯雌酚-8氘代，純度≥98%。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取適量玉米赤霉醇-4氘代和己烯雌酚-8氘代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇分別配制成1.0mg/mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。再以甲醇稀釋成與5ng/mL玉米赤酶醇和己烯雌酚峰面積或峰高相當(dāng)濃度的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用3個(gè)月。

硅膠固相萃取柱：500mg，3mL。使用前用6mL正己烷分兩次預(yù)洗硅膠柱，流速均為4mL/min。

9.2.1.4 儀器和設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有大氣壓化學(xué)電離源；分析天平：感量0.1mg和0.01g；自動(dòng)固相萃取儀或固相萃取裝置；高速均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速大于10000r/min；氮?dú)鉂饪s儀；渦旋振蕩器；離心機(jī)：轉(zhuǎn)速大于3000r/min；pH計(jì)：測(cè)量精度±0.2pH單位；具塞試管：25mL，50mL；微量注射器：25μL，100μL。

9.2.1.5 樣品前處理.

(1) 樣品制備

取有代表性樣品500g，絞碎后攪拌均勻，制成實(shí)驗(yàn)室樣品。試樣分為兩份，置于樣品盒中，密封，并做上標(biāo)記。制備好的試樣置于-18℃冰柜保存。

(2)試樣稱(chēng)取

稱(chēng)取5個(gè)陰性樣品，每個(gè)樣品為5g(精確到0.01g)，置于50mL離心管中，分別加入不同量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烷雌酚的濃度為1.25ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL；己烯雌酚和雙烯雌酚的濃度為2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分別加入適量?jī)?nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使內(nèi)標(biāo)物濃度均為10ng/mL。

(3)提取

加入20mL叔丁基甲基醚，在10000r/min轉(zhuǎn)速下高速均質(zhì)1min。3000r/min離心5min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至另一50mL具塞試管中備用。離心管中的殘?jiān)糜谕L(fēng)櫥中揮發(fā)30min，加入15mL乙酸鹽緩沖液，高速均質(zhì)1min，3000r/min離心5min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至另一25mL具塞試管中，并在氮?dú)鉂饪s儀上于40℃水浴中吹去殘余叔丁基甲基醚后，加入80μL β-葡糖苷酸酶混勻，于52℃烘箱中放置過(guò)夜。在此緩沖溶液中加入氫氧化鈉溶液將溶液pH值調(diào)至7，加入10mL叔丁基甲基醚，充分混合，3000r/min離心2min。移取叔丁基甲基醚層與前述的叔丁基甲基醚提取液混合，在氮?dú)鉂饪s儀上于40℃水浴中吹干。加入1mL溶解液，渦旋30s溶解，待凈化。

(4)凈化

把樣液轉(zhuǎn)入硅膠固相萃取柱，流速為2mL/min，在樣品試管中加入3mL淋洗液，混合后過(guò)柱，流速為2mL/min，用3mL淋洗液以3mL/min的速度淋洗，加入2mL空氣以4mL/min的速度吹過(guò)硅膠柱。用6mL洗脫液洗脫，流速為2mL/min，加入2mL空氣以6mL/min的速度吹過(guò)硅膠柱，收集洗脫液。將洗脫液在氮?dú)鉂饪s儀上于40℃水浴中吹干，加入1mL流動(dòng)相，渦旋30s溶解。溶液經(jīng)濾膜過(guò)濾后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

(5)試樣溶液的制備.

稱(chēng)取待測(cè)樣品5g(精確到0.01g)于50mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使內(nèi)標(biāo)物含量均為2.0μg/kg，按上述步驟操作。

(6)空白基質(zhì)溶液的制備

稱(chēng)取陰性樣品5g(精確到0.01g)于50mL棕色離心管中，按上述步驟操作。

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