苯并咪唑類藥物殘留分析技術——凈化方法（一）

時間：2023-03-24 23:13:26來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

苯并咪唑類藥物殘留分析技術——凈化方法（一）

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

(3)凈化方法

最初的組織樣品的處理方法是采用多重液液分配和/或固相萃取凈化。一些研究者選擇通過液液分配和固相萃取綜合凈化措施，通常采用HPLC紫外檢測；另外一些研究者傾向于采用單一的液液分配凈化，采用更具選擇性的熒光檢測和LC-MS/MS檢測。此外，常用的凈化方法還有基質固相分散、透析及超濾等。這些簡單的凈化步驟更適用于分離BMZs混合物，而采用綜合凈化措施很難同時凈化這些藥物。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

提取BMZs藥物后，根據BMZs與樣品中其他成分在互不相溶的溶劑相中的溶解度不同，可通過LLP對樣品進行凈化。有的研究者采用單一溶劑凈化，有的研究者采用多種溶劑進行凈化。

Marti等用乙腈和乙腈-水溶液從肌肉、肝臟和腎臟組織中兩次提取8種BMZs。提取液用正己烷脫脂后，采用一系列LLP凈化措施，包括先加入正已烷、氯化鈉，出現三相分層后棄去正已烷層，再加入二氯甲烷LLP，取乙腈層，干燥濃縮后進一步采用C18和Florisil柱凈化濃縮，用HPLC-紫外檢測器(UVD)檢測或氣相色譜-質譜(GC-MS)確證分析。除OFZ外，其余BMZs的回收率均大于65%，OFZ在肝和腎的回收率分別為45%和39%，LOD在20～50ng/g范圍內

Blanchflower等用甲醇-水(2+7，v/v)從肝臟和肌肉組織中提取FBZ和OFZ，提取液用石油醚洗滌，磷酸緩沖液稀釋，再用乙醚-乙酸乙酯(60+40，v/v)萃取。該方法FBZ和OFZ的平均回收率分別為91%和86%，LOD分別為0.05ug/g和0.1ug/g。Fletouris等在酸性條件下，用辛烷磺酸鹽離子對從肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織中分離提取ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2。提取液用pH8.5的磷酸緩沖液和乙酸乙酯LLP凈化，再用高度敏感的離子對HPLC檢測。方法回收率均在76%以上，RSD小于7.3%，ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的LOQ分別為20ng/g、0.5ng/g和1ng/g。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE是殘留分析中常用的凈化手段。由于BMZs的理化性質存在差異，多種類型填料的SPE柱都可以被選用。對于非極性或弱極性藥物，常采用C18、C2柱；對于極性藥物，常采用CN柱；離子型藥物可采用離子交換柱；此外，還可使用聚合柱。

A. C18柱

Su等調pH10后用乙腈提取肌肉和肝臟組織中6種BMZs，加入BHT防止TBZ-5-OH氧化，提取物再用C18 SPE柱凈化，HPLC測定。DAD檢測時，LOD在0.005～0.03μg/mL之間，FLD檢測時在0.004～0.02μg/mL之間；回收率在71%～101%之間，日內和日間CV分別為1.92%和7.22%。Allan等用酸稀釋血漿后直接過C18柱，SPE柱用20mL水、0.5mL甲醇-水(40+50，v/v)和0.4mL甲醇洗滌，再用1.6mL甲醇洗脫，HPLC檢測。MBZ及其主要代謝物的回收率均大于80%；等度洗脫時，MBZ的LOD為20ng/mL，梯度洗脫時，LOD為10ng/mL。Rouan等采用ASPEC系統對血漿中的TCB及其代謝物進行自動液固提取和凈化。采用C18一次性萃取柱富集，甲醇洗脫后，再進行色譜分析。對于有限的樣品，該試驗條件下的回收率大于96%。Hennessy等用飽和碳酸氫鈉將膽汁樣品調節至pH8.8，再用乙酸乙酯提取，在氮氣下吹干，復溶后，過預先用甲醇和水活化的C18 SPE柱，然后用10mL水洗脫，TCB代謝物收集到3mL甲醇中，氮氣吹至約0.5mL，HPLC測定。該方法TCB的LOD為20ng/mL，提取效率約在85%～90%之間。Moreno等用乙腈沉淀奶中的蛋白，然后將上清液過預先活化的C18 SPE柱，用水洗滌，甲醇洗脫，再用HPLC-UVD檢測。ABZ、FBZ及其代謝物的平均回收率在77%～97%之間。Takeba等用乙腈從奶中提取TCB、TCB-SO和TCB-SO2，然后用正己烷脫脂，乙腈相用碳酸緩沖液調節后，用二氯甲烷萃取，再用C18 SPE柱凈化，用2mL純水洗滌SPE柱，3min抽干，用2mL乙腈洗脫TCB及其代謝物，HPLC-UVD檢測。方法平均回收率在89%～95%之間。

B. C2柱

Wilson等用乙酸乙酯從綿羊、牛和豬的肝臟和肌肉組織中提取8種BMZs，接著采用酸化甲醇-正己烷LLP凈化，再用C2 SPE柱凈化。分別用6mL乙酸乙酯、3mL乙醇和3mL去離子水洗滌SPE柱，并保持柱床水分不能干，向300μL乙醇-鹽酸溶液中加2mL 2%碳酸氫鉀溶液，混勻，過柱，讓其自然流出，用1倍柱體積的水洗滌SPE柱2次，抽干，用900μL乙酸乙酯洗脫藥物及其代謝物，40℃氮氣吹干，用300μL流動相復溶，HPLC-UVD檢測。該研究發現，C2 SPE是最有效的吸附劑，能夠比其他SPE吸附劑更好地除去極性基質干擾物，同時能夠獲得較高的BMZs回收率，所有藥物及其代謝物的回收率大于80%。

C. CN柱

Cannavan等在pH7.0條件下，用乙酸乙酯從肝臟、腎臟和肌肉組織中提取TBZ和TBZ-5-OH，然后用CN SPE柱凈化。萃取柱預先用4mL正己烷活化，并保持柱床不能干，提取液過柱，抽干10min，然后用2mL含有0.2%(v/v)三乙胺-甲醇溶液2次洗脫，70℃下氮氣吹干，用200μL甲醇-乙腈-水(2+1+7，v/v)復溶，混勻，液相色譜-質譜(LC-MS)測定。采用氘代TBZ作為內標，從而提高了方法重復性。TBZ和TBZ-5-OH的回收率分別在96%～103%和70%～85%之間，LOD均小于10μg/kg。

D. 中性氧化鋁柱

田德金等用乙酸乙酯做提取劑，提取動物組織中的FLU、FBZ、ABZ和MBZ，提取液濃縮后，用乙腈復溶，正已烷脫脂，然后過中性氧化鋁小柱凈化，用乙酸乙酯-無水乙醇(4+1，v/v)溶液洗脫，40℃蒸干，殘渣用1mL乙腈-水(3+7，v/v)復溶，超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)測定。方法回收率為60%～85%，平均CV小于15%，LOQ為1ug/kg。

E. 氨丙基柱

Hajee等用pH7.5的乙酸乙酯提取鰻魚肌肉中MBZ、MBZ-NH2和MBZ-OH殘留物，加正已烷凈化，再過氨丙基SPE柱。用5mL甲醇活化萃取柱，不能流干，分別用2mL乙酸乙酯和2mL乙酸乙酯-正己烷(4+5，v/v)預洗，并保持柱床不能干，加上儲液器，將提取液加入儲液器，用5mL乙酸乙酯-正己烷(4+5，v/v)洗滌提取液容器并加到儲液器過柱，控制流速在2mL/min，用2mL異辛烷洗滌SPE柱，再讓SPE柱流干，氮氣吹干SPE柱20min，用2mL甲醇洗脫藥物到5mL玻璃試管，37℃氮氣吹干，1.0mL流動相復溶，渦動混勻，3800g離心5min，上清液HPLC分析。該方法對MBZ-OH的LOD和LOQ分別為0.7ug/kg和1.1μg/kg，對MBZ分別為1.4μg/kg和2.3μg/kg，對MBZ-NH2分別為1.5μg/kg和2.1μg/kg；日間和日內CV均小于5.8%；MBZ、MBZ-NH2和MBZ-OH的平均回收率分別為90%、74%和92%。

F. 離子交換柱

Rose等采用乙腈從肝組織中提取9種OFZ代謝物，用乙酸處理后，過強陽離子交換(SCX)柱凈化，用丙酮、甲醇和乙腈洗滌，用含有5%氨水的乙腈溶液洗脫，HPLC-UVD測定。藥物的回收率在28%～117%之間，FBZ、OFZ、TBZ、TBZ-5-OH的LOD均為5μg/kg。Arenas等測定了牛奶中的TBZ和TBZ-5-OH。乙酸乙酯提取物用PRS陽離子交換柱凈化，用含有0.1mol/L KH2PO4的乙腈-水(30+70，v/v)溶液洗脫，HPLC-FLD分析。TBZ、TBZ-5-OH和與硫酸鹽結合的TBZ-5-OH回收率分別大于87%、98%和96%，CV小于等于61%。

G. 聚合柱

Balizs等用1mL甲醇-0.1mol/L乙酸銨溶液(50+50，v/v)溶解肌肉提取物，再過聚苯乙烯-二乙烯基-苯(SDB)SPE柱，用3mL甲醇-乙酸乙酯(1+4，v/v)溶液洗脫，LC-MS/MS檢測。15種BMZs的回收率在36%～117%之間，但FEB的回收率僅為8%；方法LOD均低于6ug/kg，LOQ大多數低于10μg/kg。杜紅鴿等建立了動物肌肉組織中ABZ及其代謝物ABZ-SO、ABZ-SO2的HPLC分析方法。用乙酸乙酯提取肌肉組織樣品中的藥物，提取液濃縮后用酸性乙醇復溶，正己烷除脂，過HLB柱凈化。SPE柱依次用5mL甲醇、5mL水活化，加入樣品提取液，以較慢的速度流過后，加入3mL水淋洗，吹干柱內滯留的液體。用6mL甲醇洗脫藥物至10mL試管中，50℃氮氣吹干，加入1mL流動相溶解殘渣，過0.45um微孔濾膜后，進HPLC檢測。肌肉樣品中平均回收率為86.4%，平均CV為1.96%，3種藥物的LOD均為5ug/kg，LOQ均為20ug/kg。

H. 復合用柱

Sorensen等用乙腈從鱒魚肌肉和皮膚中提取FBZ殘留標示物，提取物用正己烷洗滌，然后過C18和CN SPE柱凈化。C18萃取柱預先用10mL甲醇、5mL水和5mL pH11.0的磷酸緩沖液活化，提取液過柱，控制流速在2～4mL/min，然后用2mL pH11.0的磷酸緩沖液洗滌，再用2mL 10%甲醇洗滌3次，抽干15min，用5.0mL乙腈洗脫樣品，洗脫液在40～45℃下氮氣吹干，殘渣復溶于50μL DMSO和2.0mL乙酸乙酯和6.0mL正己烷混合液中。CN SPE柱用10mL 1%乙酸甲醇洗滌，接著用5mL甲醇洗滌，抽干2min，接著用8mL乙酸乙酯-正已烷混合液(1+3，v/v)活化，將樣品溶液過柱，控制流速在2～4mL/min，用2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合液(1+3，v/v)洗滌5次，抽干5min，化合物用6mL 1%乙酸甲醇洗脫，在40～45℃下氮氣吹干，殘渣復溶于0.2mL DMF并用流動相稀釋至0.8mL，不過濾，HPLC-UVD檢測。對于FBZ、FBZ-SO和FBZ-SO2的LOD分別為4.0μg/kg、4.5μg/kg和3.8μg/kg；兩種組織中藥物的平均回收率均大于86%，RSD低于9.2%。Danaher等用未修飾的超臨界CO2從肝臟添加樣品中提取14種BMZs，用中性氧化鋁柱和SCX柱凈化提取物，將儲液器與MCX萃取柱相連，萃取柱預先用5mL甲醇-水-冰乙酸(54+36+10，v/v)活化，18mL樣品提取液(甲醇-水)加2mL冰乙酸酸化混勻后加到儲液器上樣，分別用2.5mL丙酮、5mL甲醇和5mL乙腈洗滌萃取柱，5mL乙腈-氨水(95+5，v/v)洗脫藥物及其代謝物，60℃氮氣吹干，加400μL甲醇-水(50+50，v/v)復溶，再用HPLC-UVD檢測。除TBZ、CAM和TCB-SO2不能定量外，其余11種BMZs的平均回收率在51%～113%之間，LOD為50μg/kg，日內及日間CV分別小于10%和32%。

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