喹諾酮類藥物殘留分析技術測定方法（一）

時間：2023-03-25 02:48:08來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

喹諾酮類藥物殘留分析技術測定方法（一）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

11.1.4.2 測定方法

國內外報道用于QNs殘留分析的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、毛細管電泳測定法(CE)等，也有報道用氣相色譜法(GC)、高效薄層色譜法(HPTLC)、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)、免疫分析方法(IA)等方法。

(1)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是最常用的分離方法，通常使用C18/C8等色譜柱，但有些情況下也引入苯基或氨基鍵合的固定相。多數方法使用經端基封閉處理的色譜柱甚或高純硅質柱，防止由于色譜柱填料殘留的硅醇基(硅羥基)和金屬雜質而導致的色譜峰拖尾。也可以在流動相中加入季銨鹽、烷基硫酸鈉或烷基磺酸鈉等離子對試劑，它們可與質子化的待測物以及三乙胺(TEA)或季銨鹽形成離子對，而TFA或季銨鹽可與待測物競爭殘留的活性硅醇基，能夠獲得更好的保留、洗脫，和更大程度的分離效果。流動相組成主要是乙腈-水，有時也使用乙腈-甲醇-水、乙腈-四氫呋喃(THF)-水或乙腈-二甲胺-水等，也有報道使用乙腈-甲醇-四氫呋喃-水四元溶劑體系，少數文獻報道有使用甲醇-水為流動相。多殘留分析常采用梯度洗脫方法，為改善峰形常在流動相中加入掃尾劑，可以減少硅醇基的電離，加入四氫呋喃(THF)，也可以減少拖尾峰。磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、草酸緩沖液等經常用于將流動相控制pH2～4，可以降低其與QNs陽離子之間的相互影響，獲得較好的分離。

HPLC常用的檢測器包括紫外檢測器(ultraviolet detector，UVD)、二極管陣列檢測器(diode-array detector，DAD)、熒光檢測器(fluorescence detector，FLD)、電化學發光檢測器(electrogenerated chemiluminescence detector，ECLD)，以及UVD和FLD聯用等。

1)熒光檢測器(FLD)

QNs分子的基本結構屬于喹啉酮類或氮雜喹啉酮類，具有很好的熒光性，常使用FLD檢測器，但不同QNs的熒光光譜又相差較大。在使用熒光檢測法進行QNs多殘留檢測時，可采用程序波長檢測法，使每個分析物的檢測波長處于其自身波長范圍內，提高檢測靈敏度和選擇性。

Rambla-Alegre等報道了采用HPLC-FLD程序熒光波長檢測雞蛋和牛奶中的DAN、DIF、FLU和MAR的方法。程序熒光檢測波長:0～9.3min，λex=260nm，λem=366nm，檢測FLU；9.3～20min，λex=280nm，λem=450nm，檢測MAR、DAN和DIF。四種QNs的回收率為96%～113.7%，RSD小于10%，LOD和LOQ分別為0.03～1.8μg/kg和0.5～6μg/kg。Herra-Herrera等報道了采用HPLC-FLD檢測牛、綿羊和山羊奶中7種堿性QNs(FLE、CIP、LOM、DAN、ENR、SAR和DIF)的方法。樣品用三氯乙酸～甲醇提取，HLB固相萃取柱凈化，HPLC-FLD檢測，激發和發射波長分別為280nm和450nm。研究發現，在流動相中添加1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(1-ethyl-3-methylimidazolium tetrafuoroborate，EMlm-BF4)色譜分離效果要優于添加1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(1-butyl-3-methylimidazolium tetrafuoroborate)，流動相為含3mmol/L EMIm-BF4和10mmol/L乙酸銨的水溶液(乙酸調pH3.0)-乙腈(87+13，v/v)，在Nova-Pak C18(150mm×3.9mm，4um)色譜柱上分離，18min內良好分離了7種QNs，且沒有干擾。在牛奶中QNs的回收率為94%～113%，LOD為0.5～6.8ug/L；在山羊奶中QNs的回收率為79%～～92%，LOD為0.6～7.7ug/L；在綿羊奶中QNs的回收率為73%～87%，LOD為0.6～8.1μg/L。Haritova等建立了HPLC-FLD法檢測禽類血清樣品中的QNs。反相色譜柱分離，CIP和ENR的激發和發射波長分別設定在277nm和418nm，DIF為295nm和500nm，MAR為338nm和425nm。流動相為乙腈和磷酸鹽緩沖液中，流速為1mL/min。標準曲線的線性范圍為10～1000ng/mL。ENR不干擾CIP、DIF和MAR的測定，用來作為DIF和MAR檢測的內標。批間RSD為1.73%～13.21%，批內RSD為1.11%～7.18%，平均回收率高于85%。Rambla-Alegre等還建立了檢測尿液中QNs的HPLC方法。樣品無需前處理，直接進樣檢測。檢測CIP、LOM、OFL、LEV和莫西沙星(moxifloxacin)時，以0.15mo/L十二烷基硫酸鈉、12.5%丙醇和0.5%三乙胺(pH3.0)為流動相，激發波長為285nm，發射波長為465nm；檢測LOM、OFL和moxifloxacin時，以0.05mol/L十二烷基硫酸鈉、2.5%丙醇和0.5%三乙胺(pH3.0)為流動相，激發波長為295nm，發射波長為485nm。在5ng/mL、50ng/mL和500ng/mL 3個添加水平，方法回收率為84.3%～116.2%，RSD低于8.4%，5種QNs的LOD低于0.5ng/mL，LOQ為1ng/mL。

李存等建立了同時檢測動物肌肉組織中9種QNs(MAR、OFL、LOM、CIP、DAN、ENR、SAR、OXO、FLU)和磺胺類藥物的HPLC-FLD檢測方法。動物肌肉組織樣品用磷酸鹽緩沖液提取，HLB固相萃取柱凈化，洗脫液氮氣吹至近干，磷酸鹽緩沖液復溶，采用甲酸水溶液-乙腈體系作為流動相，梯度洗脫，FLD測定。程序熒光檢測波長：0～11min，λex=297nm，λem=515nm；11～25min，λex=280nm，λem=450nm；25～55min，λex=320nm，λem=-365nm。方法的線性良好，相關系數(r)大于0.9987；平均回收率為70.6%～103.4%，RSD為1.2%～11.4%；QNs的LOD為0.04～0.4μg/kg。潘媛等建立了HPLC-FLD法檢測動物源性食品中6種QNs的方法。魚、肉及肝臟等樣品需經過乙腈-0.1mol/L KH2PO4緩沖液提取，乙腈飽和的正己烷洗滌去除油脂；蛋及乳制品樣品用正己烷飽和的乙腈提取，乙腈飽和的正己烷去脂。方法的回收率為82%～105%，RSD為40%～12%，NOR、CIP、SAR及DAN的LOD為5.0μg/kg，ENR、DIF為3.0μg/kg。Stoilova等建立了HPLC-FLD法同時測定6種動物源基質中9種常用QNs。該方法使用乙腈萃取，OasisHLB固相萃取柱凈化，以甲酸水溶液、甲醇和乙腈作為流動相，C18色譜柱分離，梯度洗脫，多波長激發/發射熒光檢測器分析。9種QNs的LOD和LOQ分別為3～50μg/kg和7.5～100μg/kg。回收率為77%～120%，其RSD小于30%。Takeda等建立了一種有效篩查多種動物和水產品中QNsHPLC-FLD法。目標分析物包括MAR、OFL、NOR、CIP、ENR、DAN、ORB、DIF、SAR、OXA、NAL和FLU。樣品包括10種不同的食物產品：肉(牛、豬和雞)、肝臟(雞)、生魚(蝦和鮭魚)、雞蛋和加工食品(火腿、香腸和魚香腸)。乙腈-甲醇(1+1，v/v)提取，經帶有Fe3+的固相化金屬螯合親和柱凈化，以甲醇-水-甲酸(15+85+0.1，v/v)作為流動相，反相色譜柱分離，FLD在不同激發/發射波長下進行檢測(OFL、NOR、CIP、ENR、DAN、ORB、DIF和SAR：295nm/455nm；MAR：295nm/495nm；OXA、NAL和FLU：320nm/365nm)，NOR/OFL，ORB/DIF和ENR/DAN不能完全分離。最佳條件下，日內和日間回收率分別為88.5%(56.1%～108.6%)和78.7%(44.1%～99.5%)，RSD分別為7.2%(0.7%～18.4%)和6.8%(1.4%～16.6%)；LOQ為0.8μg/kg(DAN)-6.5μg/kg(SAR)。

2)紫外檢測器和二極管陣列檢測器(UVD/DAD/PDA)

有些QNs如PIR和MAR的自身熒光較弱，多采用UVD或DAD來測定。Tsai等建立了HPLC-DAD方法檢測豬肌肉組織中的SAR、DAN、NAL、OXO、ENR、FLU和哌啶。DLLME提取和凈化，流動相為含有3.7mmol/L無水硫酸鎂和十二烷基硫酸鈉的乙腈-0.05mol/L NaH2PO4 (pH2.5)(35+65，v/v)，在Cosmosil 5C18-AR-II(5um，250mm×4.6mm)色譜柱上分離。方法回收率為93.0%～104.7%，LOD為5.6～23.8μg/kg。Bailac等建立了SPE-LC-UVD方法檢測雞組織中的7種QNs(CIP、DAN、ENR、SAR、DIF、OXO、FLU)。流動相為乙腈-檸檬酸緩沖液(12+88，v/v)，方法比較不同色譜柱的分離效果，包括Kromasil C8柱(4.6mmi.d.×250mm)、Inertsil C8柱(4.6mmi.d.×250mm)、ZorbaxEclipseXDB-C8柱(4.6mmi.d.×150mm)、LichrospherC18柱(4.6mmi.d.×250mm)和Nucleosil C18柱(4.6mmi.d.×250mm)。結果發現，使用C18柱色譜峰會變寬，而C8色譜柱色譜峰會更好，Inertsil C8和ZorbaxEclipseXDB-C8可以使SAR和ENR達到基線分離，ZorbaxEclipse XDB-C8柱分離效果最好。OXO、FLU在250nm檢測，其他QNs在280nm檢測。方法回收率為58%～107%，LOD為10～30μg/kg。Evaggelopoulou等報道了HPLC-DAD法檢測魚和烏頰魚中7種QNs。PerfectsilODS-3(250mm×4mm，5um)的色譜柱進行分離，梯度洗脫，流動相為含0.1%三氟乙酸(pH1)的乙腈和甲醇，DAD在255nm下檢測酸性QNs(OXO、FLU和NAL)，275nm下檢測CIP、DAN、ENR和SAR。

3)紫外檢測器串聯熒光檢測器(UVD-FLD)

在色譜分析中還將UVD和FLD串聯使用，可實現熒光性QNs和非熒光性QNs的同步檢測。Marazuela等利用UVD和FLD串聯檢測牛奶中CIP、ENR、MAR、DAN和SAR殘留。其中MAR利用UVD在298nm檢測，其他QNs使用FLD檢測，激發和發射波長分別為280nm和440nm。流動相為25mmol/L正磷酸溶液(NaOH調pH3.0)和乙腈，梯度洗脫，色譜柱為極性封端AQUATM C18柱(4.0mm×3.0mm，5um)。方法回收率為80%～103%，RSD低于6.6%，LOD為0.5～3ng/mL，LOQ為2.4～10ng/mL。

4) 電化學發光檢測器(ECLD)

ECLD是對電極施加一定的電壓進行電化學反應，電極反應產物之間或電極反應產物與體系中某種組分之間進行化學反應產生發光，通過測量發光光譜強度來測定物質含量的一-種痕量分析方法，具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便、易于控制，并且實驗中的一些試劑可重復使用等優點。Yao等在研究氟喹諾酮的電化學發光性質時發現，在中性磷酸鹽緩沖溶液中，電位在0～1.8V范圍內進行掃描基本沒有電化學發光；同樣條件下，過硫酸根有較弱的電化學發光；但當氟喹諾酮和過硫酸根同時存在時，同樣條件下進行電位掃描可以產生非常強的電化學發光現象，發光強度大概是單獨過硫酸根存在時的350倍。Sun等研究發現OFL在NaNO3溶液中可以直接產生電化學發光現象，結合HPLC建立了一種簡單靈敏的檢測血清中OFL含量的新方法。在最佳實驗條件下，OFL檢測的線性范圍是1.0×10-8～4.0×10-6 g/mL，LOD是4×10-9 g/mL。

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