硝基咪唑類藥物殘留分析技術——提取方法

時間：2023-03-24 23:44:08來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

硝基咪唑類藥物殘留分析技術——提取方法

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

16.1.4 殘留分析技術

硝基咪唑類藥物殘留受到各國政府的關注，其殘留檢測方法研究較多，目前主要采用儀器分析方法。Polzer等8確定了火雞服用硝基咪唑類藥物后應該檢測的目標化合物。比較了MNZ、RNZ、DMZ、IPZ及其相應的羥基化代謝產物MNZOH、HMMNI、IPZOH在火雞各組織中的含量及穩定性。檢測MNZ和RNZ時應該選擇原藥作目標化合物；在檢測DMZ和IPZ時，應選擇其代謝產物HMMNI和IPZOH作為目標化合物。

16.1.4.1 前處理方法

前處理中往往涉及濃縮吹干等步驟，本類藥物蒸汽壓較高，易被溶劑或氣流帶出損失，所以蒸發溫度不宜過高，吹蒸速度不宜過快，不要將樣品蒸干，應緩緩吹入氮氣或空氣。

(1)提取方法

提取是將生物樣品中的殘留藥物通過適宜的溶劑轉移出來，并盡量減少共萃取的樣品基質。樣品基質中硝基咪唑類藥物及其羥基代謝物在常溫下降解迅速，視網膜和血漿中樣品穩定性比肌肉和肝臟中高，合理的方法還應該保證分析物的穩定性。早期研究將樣品調節pH3，用蛋白酶過夜酶解提取與組織蛋白結合的殘留物，但近期研究表明沒必要酶解。

1)液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

由于該類藥物的堿性性質，在酸性條件下溶于水，在堿性條件下溶于有機溶劑，組織提取物用酸性水溶液復溶后，可用二氯甲烷或正己烷除脂。硝基咪唑類藥物的提取用乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷和甲苯等，溶劑極性不同，共萃取的雜質也不同，后續凈化方法也不相同。其中應用乙腈和乙酸乙酯的報道最多，禽蛋類樣品應用乙腈提取比乙酸乙酯更好，可以避免乳化現象。提取溶劑常加入適量的鹽可促使溶劑與樣品基質相分離，減少和沉淀共萃取物，其中氯化鈉應用最多。提取液常用氮氣吹至近干，該步驟很關鍵，因為過熱和干燥可能導致分析物揮發。乙酸乙酯沸點相對較低，加入少量的高沸點溶劑如二甘醇(沸點241℃)作為保持劑，可防止因蒸發溫度過高引起藥物揮發損失。

A. 乙腈提取

乙腈沉淀蛋白效果較好，與水性基質互溶，是提取組織中硝基咪唑類藥物常用溶劑之一。乙腈用于提取禽肉類樣品，回收率在79%～93%之間。Wang等用乙腈提取禽肉中MNZ、DMZ和RNZ，回收率在80%～90%之間，變異系數(CV)小于14.3%。Thompson等用乙腈提取動物腎臟、肝臟、牛奶和禽蛋中6種硝基咪唑及其代謝物，經免疫傳感器測定，DMZ、RNZ、IPZ的檢測能力(CCβ)小于1μg/kg，DMZOH、IPZOH的CCβ小于3μg/kg，MNZ和MNZOH的CCβ小于2μg/kg，但未測定回收率。Cronly等用液相色譜-質譜(LC-MS)測定了牛奶和蜂蜜中的CNZ、TNZ、TIZ、ORZ、RNZ、DMZ、MNZ、IPZ、IPZOH、HMMNI和MNZOH。3g蜂蜜加5mL水，完全溶解混勻后，加10mL乙腈、2g氯化鈉，振搖，離心，上清液用正己烷脫脂后測定；1mL牛奶用2mL乙腈、0.5g氯化鈉提取，振蕩離心后取上清液測定。以HMMNI-d3、MNZOH-d2、DMZ-d3、RNZ-d3作為內標定量。牛奶的回收率為90.8%～108.9%，檢測限(CCa)和CCβ分別為0.41～1.55μg/L和0.70～2.64μg/L；蜂蜜中CCa和CCβ分別為0.38～1.16ug/kg和0.66～1.98ug/kg。

B. 乙酸乙酯提取

乙酸乙酯與組織也有一定相溶性，適用于提取中等極性藥物，很多研究采用乙酸乙酯提取組織中硝基咪唑類藥物，但需要注意的是乙酸乙酯提取液中往往含有較多的脂肪，脫脂凈化步驟必不可少。Sun等用乙酸乙酯提取禽和豬肉中7種硝基咪唑(包括MNZ、RNZ、DMZ、TNZ、ORZ、SNZ以及RNZ和DMZ的共同代謝物HMMNI)。7種硝基咪唑類藥物檢測限(LOD)為0.2μg/kg，雞肉、豬肉中藥物回收率為71.4%～99.5%，CV分別為6.2%～13.9%和4.0%～8.7%。Zeleny等直接用乙酸乙酯提取豬肉中DMZ、MNZ、RNZ、MNZOH、IPZOH和HMMNI，提取液上清液蒸干后流動相復溶，進LC-MS測定，回收率為101%～107%，CCa和CCβ分別為0.29～0.44μg/kg和0.36～0.54μg/kg。黎翠玉等采用乙酸乙酯提取動物源食品中MNZ、DMZ和RNZ及其代謝物MNZOH、HMMN殘留，LC-MS測定。方法回收率在61.1%～108.0%之間，相對標準偏差(RSD)為1.9%～6.3%，定量限(LOQ)為0.1μg/kg。Zhou等報道用乙酸乙酯提取蜂蜜中MNZ、RNZ、DMZ、TNZ和HMMNI的殘留。MNZ、DMZ、RNZ、TNZ和HMMNI的LOD為1.0～2.0ng/g，平均回收率為71.5%～101.4%。劉玉芳等建立了高效液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)測定鹽漬羊腸衣中2種硝基咪唑殘留量。先用甲醇-丙酮均質，以乙酸乙酯萃取提取鹽漬羊腸衣中硝基咪唑類殘留物。測定出甲硝唑和洛硝噠唑的LOD均為0.5ng/mg，甲硝唑和洛硝噠唑的LOQ均為1.0ng/mg；在添加水平0.5ng/mg、1.0ng/mg、2.0ng/mg的回收率為62.7%～70.37%，RSD為3.4%～5.8%。在堿性條件下，本類藥物以分子形態存在，易溶于有機溶劑，乙酸乙酯的提取效率提高。Sakamoto等提取魚肉中MNZ、DMZ和RNZ殘留。5g組織加入1g碳酸氫鈉后用乙酸乙酯提取，LC-MS/MS測定。回收率為91.2%～107.0%，LOD為0.05～0.2μg/kg。丁濤等用4mL 0.25mol/L氫氧化鈉溶液-乙酸乙酯將蜂王漿中MNZ、DMZ和RNZ提取至乙酸乙酯相。DMZ的LOQ為2.0μg/kg，MNZ和RNZ為1.0μg/kg；回收率和CV分別為96.6%～110.6%和2.1%～7.4%。

C. 二氯甲烷提取

二氯甲烷與乙酸乙酯化學性質相似，但二氯甲烷密度較大，提取完成離心后基質浮在提取液上方，后續操作應盡量減少二次污染。用二氯甲烷提取時加入無水硫酸鈉可以吸去組織中的水分，使組織密度升高，離心時可以完全沉淀到試管底部，有利于后續操作；同時，硫酸鈉鹽析也可提高提取效率。Cannavan等根據基質特點，分別用二氯甲烷提取肌肉中的DMZ，用甲苯提取肝臟和禽蛋中DMZ。用D-DMZ內標，回收率為93%～102%，CV為1.2%～7.7%，絕對回收率接近80%，但甲苯對MNZOH的提取效率很低。高小龍用無水硫酸鈉和二氯甲烷振蕩提取雞組織(肌肉、肝臟、腎臟、脂肪)中的MNZ和DMZ殘留。組織中DMZ及DMZOH的LOQ均為1.0μg/kg；肌肉平均回收率在56.9%～76.5%之間，肝臟在63.3%～72.6%之間，腎臟在64.2%～73.3%之間，脂肪在63.5%～75.7%之間；日內CV均小于16%，日間CV均小于15%。

D. 其他溶劑提取

也有采用其他溶劑提取的報道。GB/T21318-2007測定豬肉、雞肉、牛肉、豬肝、雞肝、牛肝、豬腎、牛腎和魚肉中4-硝基咪唑、IPZ、MNZ、RNZ、MNZ、CMNI、DMZ、苯硝咪唑及其代謝物MNZOH、HMMNI時，樣品用硅藻土混勻，加飽和氯化鈉、甲醇-丙酮(3+1，v/v)，再均質提取3min，離心后取上層液，LC-MS/MS測定。LOD達到0.5～1μg/kg，回收率為71.4%～115%。該提取過程類似于QuEChERS，相對較為簡單。Semneiku等測定雞血中的MNZ和DMZ殘留，取1mL血清并加入20%的三氯乙酸甲醇溶液1mL，混合后離心，取上清液過濾膜后用高效液相色譜(HPLC)分析。血清中LOD為5ng/mL，回收率為82%～94%，CV小于10%。

2)超聲輔助萃取(ultrasonic-assisted extraction，UAE)

UAE是利用超聲波輻射壓強產生的強烈空化效應、機械振動、擾動效應、高加速度、乳化、擴散、擊碎和攪拌作用等多級效應，增大物質分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標成分進入溶劑，促進提取的方法。UAE適用于勻漿的組織和結構松散的樣品(如蜂蜜、牛奶)。GB/T21318-2007測定奶粉和蜂蜜中的4-硝基咪唑、IPZ、2-甲硝唑、RNZ、MNZ、CMNI、DMZ、苯硝咪唑殘留及其代謝物MNZOH、HMMNI時，用10mL飽和氯化鈉水溶液和70mL甲醇-丙酮(3+1，v/v)超聲波輔助提取30min，離心后取上層液體，經固相萃取凈化，LC-MS/MS測定，LOD達到0.5～1μg/kg，回收率為71.4%～115%。

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