雜交試驗中用于降低背景的封閉劑

試劑

用途

denhardt試劑

northern雜交

使用rna探針的雜交

單拷貝序列的southern雜交

將dna固定于尼龍膜上的雜交

denhardt試劑通常配制50×貯存液，過濾后保存于-20℃。可將該貯存液10倍稀釋于預雜交液（常為含有0.5%sds和100μg/ml經變性被打斷的鮭精dna的6×ssc或6×sspe）中。50×denhardt液中含5g聚蔗糖（ficoll,400型，pharmacia）、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（組分v”sigmal），加水至終體積為500ml。

blotto

grunstein-hogness雜交

benton-davis雜交

除單拷貝序列southern雜交以外的所有southern雜交

斑點印跡

1×blott（牛乳轉移技術優化液，bovine lacto transfer technique optimizer）,是含5%膠脂奶粉和0.02%疊氮鈉的水溶液，應保存于4℃。使用前可用預雜交液稀釋25倍。blotto不應與高濃度的sds并用，因為后者會導致牛奶中蛋白質析出。如果雜交背景不合要求，可在雜交液中加入np-40至終濃度為1%。blotto不能用作northern雜交的封閉劑，因為這一封閉劑中可能含有rna酶，其活性之高使人無法接受。

注意：疊氮鈉有毒性，取用時需戴手套小心操作。含疊氮鈉的溶液應予明確標記。

肝素

southern雜交

原位雜交

肝素（sigma h-7005，從豬中提取的二級產品或相當等級的產品）用4×sspe或4×ssc溶解配制成50mg/ml的濃度，保存于4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的雜交液中用作封閉劑的濃度為500μg/ml，在不含葡聚糖硫酸酯的雜交液中的濃度為50μg/ml。

經變性并被打斷的鮭精dna

southern和northern雜交

把鮭魚精子dna（sigma,ⅲ,鹽鈉）溶解于水配制成10mg/ml的濃度，必要時于室溫磁力攪拌2～4h助溶。把溶液中nacl的濃度調至0.1mol/l，并用酚和酚/氯仿各抽提一次，回收水相。合dna溶液快速通17號皮下注射針頭12次，以剪切dna。加入2倍體積用冰預冷的乙醇沉淀dna。離心回收dna并重溶于水，配制成10mg/ml的濃度，測定溶液的od₂₆₀值并計算出精確的dna濃度，然后煮沸10min，分裝成小份保存于-20℃。使用前置沸水浴中加熱5min，然后迅速在冰浴中驟冷。預雜交液中應含有100μg/ml經變性并被打斷的鮭魚精子dna